利用胎肝细胞移植构建 α- 地中海贫血小鼠模型，助力疾病研究新突破

研究人员为构建 α- 地中海贫血（α-thalassemia）小鼠模型，开展胎肝细胞移植研究，成功建模并分析血液学参数，意义重大。

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地中海贫血，这个名字或许大家并不陌生，但它背后隐藏的危害却鲜为人知。α- 地中海贫血作为其中一种类型，在全球范围内影响着众多人群。它是一种遗传性血液疾病，由于 α- 珠蛋白链生成减少，打破了 α 与 β 珠蛋白的平衡，从而引发一系列病理变化，如无效红细胞生成、红细胞寿命缩短、慢性溶血等 。临床症状轻重不一，从无症状携带到严重的输血依赖型，甚至危及生命，而这一切很大程度上取决于基因型。据估计，全球 5%-20% 的人口携带一个或多个 α- 地中海贫血突变基因，并且随着国际人口迁移，其在北欧、美洲等原本发病率较低的地区也愈发常见。

重型 α- 地中海贫血，也就是巴特斯水肿胎儿综合征（Barts hydrops fetalis syndrome，BHFS），堪称 α- 地中海贫血中最严重的 “杀手”。当四个 α 珠蛋白基因全部缺失或失活时，就会引发这种病症，它会破坏胚胎到胎儿血红蛋白生成的正常转换，导致胎儿出现进行性贫血、肝脾肿大，最终可能引发心力衰竭。对于这类严重贫血（血红蛋白水平低于 7g/dL）的患者，目前主要治疗方法是定期输血。然而，宫内输血虽然能让胎儿度过围产期，但却带来了复杂的伦理问题，而且幸存者往往需要终身输血，还会面临慢性输血治疗带来的各种并发症，如铁过载及其相关并发症。造血干细胞移植（HSCT）虽被视为唯一的治愈方法，但由于配型困难，大多数患者难以从中受益。由此可见，开发有效的 α- 地中海贫血治疗策略迫在眉睫，而这一切都离不开一个可靠的小鼠模型。目前，虽然有相关模型的研究报道，但仍存在诸多不足，比如现有模型构建方法缺乏详细描述，部分模型无法产生可用于后续药物筛选和疗效评估的活体小鼠 。

为了解决这些难题，上海医药罕见病医药有限公司的研究人员 Xin Xu、Wencheng Fu 和 Wenrui Ye 开展了一项重要研究。他们成功构建了一种 α- 地中海贫血小鼠模型，并对其血液学参数和相关表型指标进行了全面分析。该研究成果发表在《Scientific Reports》上，为 α- 地中海贫血的研究开辟了新的道路。

在这项研究中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先，利用 CRISPR/Cas9 技术构建了携带特定基因敲除的小鼠模型。通过精心设计引物，运用聚合酶链反应（PCR）对胎儿小鼠进行基因分型，准确筛选出目标基因敲除的小鼠。然后，从特定的胎儿小鼠中获取胎肝细胞，将其移植到经过 800 cGy 照射预处理的野生型小鼠体内，以此构建 α- 地中海贫血小鼠模型。在后续研究中，采用自动分析仪对小鼠进行血液学参数评估，利用煌焦油蓝染色检测 HbH 包涵体。

下面让我们详细了解一下研究结果：

1. 基因编辑与小鼠模型构建：研究人员借助 CRISPR/Cas9 技术，成功在小鼠的单条染色体上敲除了 Hba-a₁（E1-3）和 Hba-a₂（E1-3）等位基因，得到了具有 α- 地中海贫血特征（α^--/α⁺⁺）的 F0 代小鼠。随后，让 F0 代杂合子雌雄小鼠交配，通过 PCR 基因分型筛选出 F1 代中携带 α^--/α^--纯合敲除基因型的胎儿小鼠。接着，获取这些纯合胎儿的胎肝细胞，将其移植到经照射的 CD45.1 小鼠体内，成功构建出缺失四个 α- 珠蛋白基因的成年小鼠模型。
2. 血液学参数变化：对建模小鼠在术后 28 天、42 天和 56 天进行血液学评估发现，其白细胞（WBC）和淋巴细胞计数在初始阶段高于对照组，随着时间推移逐渐下降，到 56 天时与对照组无明显差异，这表明初期存在免疫反应，之后逐渐减弱。红细胞计数（RBC）、血细胞比容（HCT）、红细胞分布宽度变异系数（RDW_CV）和红细胞分布宽度标准差（RDW_SD）显著高于对照组，而平均红细胞血红蛋白含量（MCH）和平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）明显降低。血红蛋白（HGB）和平均红细胞体积（MCV）从 28 天到 56 天呈恢复趋势，反映了红细胞的代偿机制。此外，平均血小板体积（MPV）、血小板分布宽度（PDW）和血小板大细胞比率（P_LCR）百分比高于对照组，嗜碱性粒细胞（Bas）百分比逐渐上升，血小板计数（PLT）、血小板压积（PCT）和大血小板计数（P_LCC）下降，提示血小板功能异常和贫血加重。网织红细胞百分比（RETI %）和绝对网织红细胞计数（RETIC_ABS）从 28 天到 56 天逐渐升高，表明溶血风险增加。
3. HbH 包涵体与体重、脾脏变化：通过煌焦油蓝染色检测发现，模型小鼠体内 HbH 包涵体数量显著高于对照组，进一步证实了 β- 珠蛋白四聚体的形成。从 35 天起，模型小鼠体重明显低于对照组，且持续下降，到 56 天时体重差异具有高度统计学意义。与之相反，56 天时模型小鼠脾脏重量比对照组高约 8 倍，呈现出典型的 α- 地中海贫血脾肿大特征。
4. 排除移植物抗宿主病与嵌合血液表型：实验前的初步试验显示，模型组和野生型组在最初 22 天的移植物抗宿主病（GVHD）评分均为 0，且未进行胎肝细胞移植的对照组小鼠在 15 天死亡，排除了实验方法诱导 GVHD 的可能性。流式细胞术（FACS）分析证实，移植三周后小鼠建立了嵌合血液表型，mCD45.2⁺细胞约占 85%，mCD45.1⁺细胞约占 10%。

研究结论和讨论部分指出，本研究验证了胎肝细胞移植在成年小鼠中构建 α- 地中海贫血小鼠模型的有效性。模型小鼠血液学参数的变化、HbH 包涵体的形成、体重减轻和脾肿大等特征，都与临床 α- 地中海贫血患者的关键特征相似。这一模型不仅为研究 α- 地中海贫血的发病机制提供了有力工具，还为后续药物研发、基因治疗等研究搭建了重要平台。它能够帮助科研人员深入探究疾病的分子机制，测试潜在的治疗方法，有望推动 α- 地中海贫血治疗领域取得新的突破。

不过，在研究过程中也有一些需要注意的地方。首先，虽然该模型成功模拟了人类严重 α- 地中海贫血的部分特征，但与真实的人体疾病状态可能仍存在差异，在将研究结果外推至人体时需谨慎。其次，实验中使用胎肝细胞作为移植材料，虽然其具有独特优势，但也涉及一定的伦理考量，在后续研究中应持续关注并遵循相关伦理规范。最后，目前的研究主要集中在模型构建和血液学参数分析方面，未来还需要进一步深入研究模型小鼠的其他生理病理变化，以及探索更多针对 α- 地中海贫血的有效治疗策略。