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本文开发了一种共价工程改造的 ACE2 纳米囊泡喷雾剂（nanoSpray），能有效抑制 SARS-CoV-2 感染，为抗疫提供新策略。
### 呼吸道病毒感染现状与现有治疗策略困境
呼吸道病毒，如严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 型（SARS-CoV-2）和流感病毒，对全球健康、金融系统和社会结构产生了深远影响。这些病毒通常通过其特定蛋白与宿主细胞上的进入受体相互作用来感染健康细胞，比如 SARS-CoV-2 的刺突蛋白（spike protein）与人类血管紧张素转化酶 2（hACE2）的配对。针对病毒特异性蛋白，干扰其与进入受体相互作用的中和药物（如小分子、肽和抗体），是一种关键且有前景的治疗策略。然而，呼吸道病毒进化和变异迅速，存活的突变通常会削弱甚至消除现有中和药物的效力。同样，在疫情早期快速推出的抗病毒疫苗，虽然是基于病毒特异性蛋白设计的，但特异性蛋白的快速突变极大地限制了其疗效。因此，迫切需要能够有效且广泛抑制呼吸道病毒感染的新型治疗试剂，理想的给药方式是通过吸入或鼻喷雾剂。
在病毒变异过程中，宿主细胞上的进入受体相对稳定。重组进入受体因此被开发出来作为诱饵，以应对病毒突变。但这类中和药物与健康细胞上的进入受体相比，没有结合亲和力优势，所以必须持续保持血液中这些药物的高浓度以维持其疗效。细胞外囊泡（EVs）参与病毒感染的病理过程，作为抗病毒治疗手段也展现出了有前景的潜力。更重要的是，由于大多数蛋白质是膜蛋白，EVs 天然地利用蛋白质展示平台来提高蛋白质的功效。例如，与重组 hACE2 蛋白相比，展示 hACE2 的循环 EVs 在预防多种 SARS-CoV-2 毒株感染方面，效力大约高 70 倍。尽管如此，细胞产生的 EVs 产量不足以用于治疗。
细胞衍生的纳米囊泡（NVs），通过对细胞膜进行超声处理和挤压制备而成，被视为 EVs 的替代品。此前研究表明，工程化的 NVs 可作为诱饵捕获 SARS-CoV-2 和细胞因子，从而抑制病毒感染并减轻肺部炎症。此外，由于其良好的生物安全性和中空结构，NVs 被认为是下一代递送系统。然而，目前的 NVs 通过病毒特异性蛋白与宿主进入受体之间的非共价结合来抑制病毒感染，这种结合在低浓度下不可避免地会导致可逆解离，从而降低 NVs 的中和效率，限制了它们的进一步广泛应用。
共价工程改造的 ACE2 纳米囊泡喷雾剂（nanoSpray）的开发
受能够不可逆地与靶标交联的共价药物启发，研究团队开发了一种共价工程改造的 ACE2 纳米囊泡喷雾剂（nanoSpray），用于对 SARS-CoV-2 的广谱防护。nanoSpray 的制备分为四个步骤：首先，通过计算机辅助筛选，确定非天然氨基酸氟硫酸 - L - 酪氨酸（FSY）的候选掺入位点；接着，将掺入 FSY 的 ACE2 蛋白转染到细胞中；然后，从转染 FSY-ACE2 的细胞中分离出 NVs；最后，将其与具有黏膜粘附性的佐剂透明质酸（HA）混合。这种共价 nanoSpray 在体外能不可逆地中和野生型（WT）SARS-CoV-2 和 Omicron 变异株，在体内肺滞留时间显著延长。在感染 SARS-CoV-2 的小鼠模型中，单次吸入 nanoSpray 能显著抑制病毒感染，减轻肺损伤，并提高动物存活率。研究团队期望这种利用共价化学和囊泡递送制备的可吸入 nanoSpray，能为开发简单、快速且有效的针对 SARS-CoV-2 和其他呼吸道病毒的治疗策略提供新的思路。
FSY-ACE2-NVs 的制备
利用通过基因密码扩展实现的邻近促进硫（VI）氟交换（SuFEx）点击化学，可用于工程化共价蛋白结合剂和受体。为了获得具有高交联效率的共价 hACE2，研究人员基于 hACE2 - 刺突受体结合域（RBD）的复杂结构（PDB: 7DMU），筛选掺入非天然氨基酸 FSY 的候选位点。考虑到邻近促进交联的固有化学性质，首先选择刺突 RBD 在相互作用界面周围的亲核残基，包括 K417、Y421、Y449、Y453、Y473、Y489 和 Y505，使其与插入 FSY 的 hACE2 形成稳定的共价键。随后，由于 hACE2 的近端残基 E23、E37、D38、Y41 和 Q42 具有合适的空间取向和距离，也被选择用于 FSY 的位点特异性掺入。
为了生成与 RBD 交联效率最高的共价 hACE2，研究人员将编码用于 FSY 掺入的氨酰 - tRNA 合成酶 chFSYRS 的 pCMV3 载体，和含有上述位点（即 E23、E37、D38、Y41 和 Q42）琥珀密码子（TAG）用于共价工程改造的 hACE2 的 pCMV3 载体，共转染到 HEK293T 细胞中。然后，将 WT-RBD 与转染的 HEK293T 细胞孵育，通过十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）验证 hACE2 与 WT-RBD 之间的共价连接。在这五个候选位点中，hACE2-E23FSY 与 RBD 的不可逆交联能力最强。通过荧光成像和流式细胞术进一步证实，在转染 chFSYRS 和存在 FSY 的情况下，共价工程改造的 hACE2-E23FSY 存在于细胞膜上。
获得 FSY-ACE2 转染的细胞后，通过低渗裂解、物理超声、机械挤压和梯度分离等有序处理，去除细胞内物质。随后，通过在微型手动挤出机上，使细胞膜片段通过纳米孔进行超声处理和挤压，制备出 FSY-ACE2-NVs。蛋白质免疫印迹法（Western blotting）表明，FSY-ACE2-NVs 从转染 FSY-ACE2 的源细胞中继承了关键的 hACE2 蛋白。值得一提的是，流式细胞术量化得出，ACE2+ NVs 在所得 FSY-ACE2-NVs 中的比例超过 80%，这为其后续的体内治疗应用提供了支持。透射电子显微镜（TEM）和动态光散射（DLS）进一步证实，FSY-ACE2-NVs 是平均大小约为 150nm 的中空脂质泡。值得注意的是，FSY-ACE2-NVs 在不同缓冲液中至少 2 周内保持稳定的大小，并且对细胞表现出可忽略的毒性。作为对照，研究人员也用类似的程序制备了非共价 ACE2-NVs。
FSY-ACE2-NVs 在体外的不可逆结合与对 SARS-CoV-2 的抑制作用
为了评估 FSY-ACE2-NVs 与 SARS-CoV-2 的结合情况，研究人员开发了一种基于流式细胞术的检测方法，用于测试宿主细胞与病毒 RBD 结构域之间的相互作用。不出所料，高表达 hACE2 的 HEK293T 细胞与近红外荧光 AF647 标记的 RBD 探针表现出强烈且特异性的结合。而且，细胞结合 RBD 探针的信号，即 AF647+细胞百分比和平均荧光强度，会因与 FSY-ACE2-NVs 共孵育而受到显著抑制，且呈剂量依赖性。基于这种 RBD 结合检测，FSY-ACE2-NVs 在 ACE2+ HEK293T 细胞上的 50% 抑制浓度（IC50）值为 89.94pM，而可溶性 hACE2 蛋白和 ACE2-NVs 阻止 RBD 与宿主细胞结合的 IC50 值为 9.01nM。因此，与 hACE2 蛋白或 ACE2-NVs 相比，FSY-ACE2-NVs 阻断 SARS-CoV-2 RBD 与宿主细胞结合的效率大约高 100 倍。SDS-PAGE 分析进一步证实，FSY-ACE2-NVs 能够不可逆地结合 WT-RBD 和 Omicron-RBD，这表明其在抑制 SARS-CoV-2 及其逃逸变异株感染方面具有很大的潜力。
随后，研究人员测试了 FSY-ACE2-NVs 对抑制 WT SARS-CoV-2 及其逃逸变异株感染性的效果。基于带有 Luc2-IRES-Cherry 报告基因的假病毒模型，通过对表达 Cherry 的细胞进行流式细胞术分析发现，FSY-ACE2-NVs 能显著预防假病毒感染。值得注意的是，FSY-ACE2-NVs 的 IC50 值为 19.95pM，与 hACE2 蛋白和 ACE2-NVs 相比，其对假病毒的中和效率大约高 8 倍和 15 倍。此外，在真实的 SARS-CoV-2 感染实验中，根据 Caco-2 细胞活性的降低情况，FSY-ACE2-NVs 的 IC50 值为 41.92 - 63.10pM，与 hACE2 蛋白相比，其抑制 WT 毒株感染的能力至少提高了 60 倍。实时聚合酶链反应（RT-PCR）进一步验证了 FSY-ACE2-NVs 对感染的 Caco-2 细胞中病毒载量的抑制作用。正如预期的那样，由于相似的共价键，FSY-ACE2-NVs 与 FSY-ACE2-Fc 和 FSY-ACE2-His 表现出相似的病毒中和效率。此外，为了测试 FSY-ACE2-NVs 对中和 SARS-CoV-2 逃逸变异株的能力，研究人员使用了假型和真实的 SARS-CoV-2 Omicron 变异株。值得注意的是，FSY-ACE2-NVs 预防 Omicron 变异株感染的效率，比预防 WT 毒株大约高 5 倍。总体而言，这些结果证明了使用共价工程改造的 FSY-ACE2-NVs，作为抑制或限制 SARS-CoV-2 及其突变株感染的潜在策略是可行的。
FSY-ACE2-NVs 在体内的肺滞留与冻干制剂
对于呼吸道疾病而言，无创吸入是一种具有吸引力的药物递送策略，因为它具有良好的患者依从性和较低的全身不良反应。然而，气道黏液的异物清除作用，总是会限制吸入药物的治疗效果。黏膜粘附剂是常用的材料，它可以通过降低黏液纤毛运输速度，来提高药物在肺部的滞留能力和生物活性。在这项研究中，研究人员使用黏膜粘附佐剂 HA，来测试其促进 FSY-ACE2-NVs 肺部滞留的能力。含有 HA-FSY-ACE2-NVs 的吸入液滴直径约为 3μm，有助于其有效递送至肺泡。在吸入荧光蛋白标记的 FSY-ACE2-NVs（添加或不添加 HA）后，研究人员收集小鼠的主要器官，并使用体内成像系统进行观察。结果发现，添加黏膜粘附佐剂 HA 后，FSY-ACE2-NVs 在肺部显示出最强的荧光，这表明 HA-FSY-ACE2-NVs 在肺部的积累增强。更重要的是，HA 显著提高了 FSY-ACE2-NVs 在肺部的滞留时间，超过 96 小时，这可以减轻未来日常使用中频繁给药的压力。
生物制品，包括疫苗和抗体，通常需要复杂的储存策略来保持其生物活性。幸运的是，用冷冻保护剂制备的冻干制剂，通常可以储存数年而不影响药物效率。因此，研究人员使用常用的冷冻保护剂蔗糖，来制备 FSY-ACE2-NVs 的冻干制剂。研究人员首先研究了添加蔗糖的 FSY-ACE2-NVs 和 HA-FSY-ACE2-NVs 在冻干和缓冲液复溶后的变化，结果表明蔗糖对 FSY-ACE2-NVs 的 zeta 电位和动态大小几乎没有影响。正如预期的那样，即使经过冻干处理，蔗糖 - HA-FSY-ACE2-NVs 仍保持超过 90% 的高中和效力。更重要的是，与在 4°C 储存 1 个月的 HA-FSY-ACE2-NVs 溶液相比，蔗糖 - HA-FSY-ACE2-NVs 冻干制剂抑制假病毒感染的能力得到了显著保留。因此，这种可吸入的蔗糖 - HA-FSY-ACE2-NVs 冻干制剂，具有长期储存和使用方便的特点，可能是保护宿主细胞免受呼吸道病原体感染的理想策略。
FSY-ACE2-NVs 在体内的生物相容性与对 WT SARS-CoV-2 感染的抑制作用
潜在的体内毒性，仍然是药物递送系统的一个主要问题。尽管使用 NVs 在一定程度上可以降低异物引起的免疫排斥反应，但该方法的免疫原性仍需进一步检验。在这项研究中，研究人员使用接受吸入 PBS 或含有 nanoSpray（即蔗糖 - HA-FSY-ACE2-NVs 制剂）的 PBS 的小鼠，进行体内毒性评估。在 15 天内，nanoSpray 组和对照组之间，既没有观察到死亡现象，也没有显著的体重差异。此外，血清生化、全血和细胞因子水平测试表明，吸入 nanoSpray 不会对实验动物造成明显的副作用，这为 nanoSpray 后续的体内治疗应用提供了支持。
之后，研究人员在 K18-hACE2 转基因小鼠中，进一步评估 nanoSpray 的抗病毒能力。这种小鼠的肺上皮细胞高度表达 hACE2 蛋白，非常适合用于 SARS-CoV-2 研究。小鼠经鼻内接种 SARS-CoV-2（1×104 PFU，WT 毒株），然后在感染后第 1 天，接受含有 100μg FSY-ACE2-NVs 的 nanoSpray、等量 hACE2 蛋白或 ACE2-NVs 的吸入给药。在这个模型中，FSY-ACE2-NVs 提供了比其他组更好的保护，疾病发作延迟，这从 14 天内监测的体重减轻情况可以看出。值得注意的是，FSY-ACE2-NVs 组的存活率高达 90%，而 ACE2-NVs 组为 40%，hACE2 组和未治疗组的小鼠在感染后第 8 天全部死于病毒感染，存活率为 0%。在感染后第 3 天，支气管肺泡灌洗液（BALF）中检测不到病毒载量，进一步验证了 FSY-ACE2-NVs 的抗病毒效果，而且共价 FSY-ACE2-NVs 处理的小鼠的病毒载量，甚至比非共价 ACE2-NVs 组低约 10 倍。对肺组织中细胞因子 RNA 水平的 RT-PCR 测量，和血清中细胞因子的多重免疫分析进一步表明，FSY-ACE2-NVs 有效地减轻了局部和全身炎症。肺组织的组织学检查进一步证实，共价 FSY-ACE2-NVs 显著抑制了肺损伤。由于含有 FSY-ACE2-NVs 的 nanoSpray 在肺部的积累增强，FSY-ACE2-NVs 的治疗效果，比 FSY-ACE2-Fc 和 FSY-ACE2-His 有了显著提高。
FSY-ACE2-NVs 在体内对 Omicron 变异株感染的治疗与预防作用
随着 SARS-CoV-2 在全球范围内持续传播，出现了多种令人担忧的变异株（VOCs），如 Alpha、Beta、Gamma、Delta 和 Omicron。为了研究可吸入 nanoSpray 对 Omicron 变异株感染的保护潜力，研究人员给转基因小鼠经鼻内接种 SARS-CoV-2（2×103 PFU，Omicron 变异株），然后让其吸入含有 20μg FSY-ACE2-NVs 的 nanoSpray。在感染 Omicron 变异株的小鼠中，6 只未治疗的小鼠中有 2 只在感染后第 12 天死于病毒感染，而所有接受 FSY-ACE2-NVs 治疗的小鼠都存活了下来。虽然两组小鼠在感染后的前 9 天都有轻微的体重下降，但体重变化趋势与存活曲线相似，FSY-ACE2-NVs 组相对稳定，而未治疗组小鼠体重有中度下降。更重要的是，在感染后第 3 天，接受 FSY-ACE2-NVs 治疗的小鼠肺部检测不到病毒，而未治疗小鼠肺部的病毒载量达到约 1,258.9 PFU/mL，这进一步证实了可吸入 nanoSpray 对 Omicron 变异株的强大抑制作用。
对于病毒感染，预防策略与治疗方法同样重要，甚至更为重要。基于 K18-hACE2 转基因小鼠，研究人员进一步测试了可吸入 nanoSpray 预防 Omicron 变异株感染的有效性。具体来说，小鼠吸入不同浓度的 FSY-ACE2-NVs（即 20μg、10μg 或 5μg），然后在吸入 1 天后经鼻内接种 SARS-CoV-2（2×103 PFU，Omicron 变异株）。值得注意的是，单次吸入 10μg 或更多 FSY-ACE2-NVs 的所有小鼠都存活了下来，而 6 只未治疗的小鼠中有 2 只死于 Omicron 变异株感染。与体重有中度下降的未治疗小鼠相比，吸入 10μg 或更多 FSY-ACE2-NVs 的小鼠体重保持相对稳定。此外，FSY-ACE2-NVs 的抗病毒效果，通过肺部较低的病毒载量得到了验证。总体而言，可吸入 nanoSpray 在体内对 SARS-CoV-2 及其新兴变异株的攻击，显示出强大而广泛的保护作用。
研究结论
综上所述，研究团队利用基因密码扩展和囊泡蛋白展示技术，开发了一种共价工程改造的 ACE2 囊泡 nanoSpray。所得的 FSY-ACE2-NVs 通过与病毒 RBD 不可逆交联，有效地中和了 WT SARS-CoV-2 和逃逸的 Omicron 变异株。由共价 FSY-ACE2-NVs 和黏膜粘附佐剂 HA 制备的可吸入 nanoSpray 制剂，在肺部的滞留时间显著延长了 20 多倍。在 K18-hACE2 转基因小鼠中，单剂量<在 k18-hace2 转基因小鼠中，单剂量的可吸入 nanospray 能高效抑制野生型 sars-cov-2 和 omicron 变异株感染，减轻肺损伤，降低动物死亡率。值得注意的是，在感染前给予极低剂量的可吸入 nanospray，可有效保护小鼠免受 omicron 变异株感染长达 24 小时。此外，这种 nanospray 的冻干制剂可长期保存 1>
该 FSY-ACE2-NVs nanoSpray 平台相较于现有治疗策略具有多项独特优势。其一，共价工程改造的 FSY-ACE2-NVs 能不可逆地结合病毒 RBD，为抵御不同病毒突变提供有效保护。其二，可吸入 nanoSpray 给药方式对呼吸道疾病具有吸引力，患者依从性良好。其三，该平台中使用的黏膜粘附佐剂显著延长了 FSY-ACE2-NVs 在肺部的滞留时间，并具有理想的中和效果。其四，添加冷冻保护剂的冻干过程能高度保留 FSY-ACE2-NVs 的生物活性，即便长期储存也不影响，显著提高了其未来广泛应用的可行性。最后，利用工程细胞系大规模生产 FSY-ACE2-NVs 具有可预测性。
尽管该研究成果前景广阔，但目前 FSY-ACE2-NVs 的构建依赖于 ACE2 蛋白的 E23FSY 与 RBD 蛋白的 Y473 之间形成的共价键。然而，Y473 的突变会显著削弱其中和能力，甚至与非共价 ACE2 NVs 的中和能力相当。因此，为解决新冠病毒逃逸突变株带来的问题，值得尝试在 ACE2 上更多的 FSY 插入位点，如可能与 RBD 蛋白的 Y449 形成共价偶联的 D38FSY 构建体，或者用更长、更灵活的非天然氨基酸替代 FSY，以实现对 RBD 蛋白上其他亲核残基的靶向共价交联。总体而言，这种 nanoSpray 策略在应对 SARS-CoV-2 及其他呼吸道病毒不断出现的突变株时，具有融入日常防护的巨大潜力。
