ROS-ATM-CHK2 轴调控 HIF-1α 稳定性促进肿瘤血管生成：肿瘤研究新突破

为探究缺氧肿瘤微环境中 HIF-1α 的调控机制，研究人员发现 ROS-ATM-CHK2 轴稳定 HIF-1α 促进肿瘤血管生成，为抗血管生成疗法提供理论依据。

　　

在肿瘤的世界里，缺氧是一个极为常见且关键的 “角色”。肿瘤在生长过程中，随着体积不断增大，内部的细胞逐渐难以获得充足的氧气供应，就像在沙漠中逐渐缺水的植物。缺氧会引发一系列变化，其中缺氧诱导因子 1α（HIF-1α）的激活是肿瘤细胞应对缺氧环境的关键环节。HIF-1α 就像一个 “指挥官”，能调节众多基因的表达，帮助肿瘤细胞适应缺氧状态，还能刺激肿瘤组织血管生成，为肿瘤的生长和转移提供 “补给线”。

目前，针对肿瘤的抗血管生成治疗虽然取得了一定成果，但也面临诸多挑战。例如，长期的缺氧会使肿瘤细胞产生适应性反应，导致对治疗药物产生耐药性。而且，虽然 HIF-1α 被认为是一个有潜力的抗血管生成靶点，但目前还没有获批的选择性 HIF-1α 抑制剂用于临床治疗。因此，深入了解 HIF-1α 在缺氧肿瘤微环境中的调控机制，对于开发更有效的抗血管生成疗法至关重要。

为了揭开这一神秘的面纱，中国医科大学等多家机构的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Oncogene》杂志上，为肿瘤治疗领域带来了新的曙光。

在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。细胞实验方面，通过培养 HEK293 和 H1299 等细胞系，在不同的氧气浓度条件下进行培养，模拟肿瘤的缺氧和正常氧环境。利用免疫共沉淀（Co-IP）技术，检测蛋白质之间的相互作用；采用蛋白质免疫印迹（Western blot）分析，检测蛋白的表达水平。动物实验上，使用 BALB/C 裸鼠构建肿瘤模型，观察肿瘤的生长和血管生成情况。还进行了免疫组化（IHC）分析，检测肿瘤组织中相关蛋白的表达。同时，研究人员收集了 50 例非小细胞肺癌（NSCLC）患者的临床样本，进一步验证研究结果。

下面来看看具体的研究结果：

1. HIF-1α 在缺氧条件下由磷酸化的 CHK2 维持：研究人员将 HEK293-WT 和 HEK293-CHK2-KO 细胞置于缺氧环境（1% O2? ）中培养，通过 Western blot 分析发现，在 HEK293-WT 细胞中，缺氧能显著激活 p-CHK2（Thr68），同时 HIF-1α 及其下游靶标血管内皮生长因子（VEGF）表达上调；而在 HEK293-CHK2-KO 细胞中，缺氧不能增加 HIF-1α 和 VEGF 的表达。CHK2 抑制剂可逆转缺氧诱导的 HIF-1α 表达增加。此外，研究还发现，缺氧通过 ROS 激活 ATM/CHK2 通路，进而促进 HIF-1α 表达，增强缺氧信号。

2. CHK2 通过阻断 HIF-1α 的泛素化来稳定 HIF-1α：在 H1299 细胞中过表达 CHK2，发现 HIF-1α 蛋白水平呈剂量依赖性增加。研究表明，CHK2 可通过蛋白酶体途径显著减少缺氧条件下 HIF-1α 的降解。CHK2 基因敲除（KO）会降低缺氧条件下 HIF-1α 的蛋白浓度，且这种效应不受溶酶体抑制剂氯喹的影响，但可被蛋白酶体抑制剂 MG132 维持。Co-IP 分析结果显示，与 WT HEK293 细胞相比，CHK2-KO HEK293 细胞中 HIF-1α 的泛素化增加。这些结果表明，CHK2 通过阻断泛素 - 蛋白酶体系统（UPS）降解途径来稳定 HIF-1α。

3. 缺氧促使 CHK2 诱导 HIF-1α 在 Thr645 位点磷酸化：免疫荧光和共聚焦显微镜结果显示，CHK2 和 HIF-1α 在肿瘤组织和 H1299 细胞的细胞核中存在共定位现象，且缺氧可促进这种共定位。Co-IP 实验证实，缺氧能增强 H1299 细胞和 HEK293 细胞中 CHK2 与 HIF-1α 的相互作用。通过体外 CHK2 激酶实验和磷酸化位点质谱分析，发现 CHK2 可使 HIF-1α 在 Ser641、Ser643 和 Thr645 位点磷酸化。其中，Thr645 是位于 HIF-1α 抑制结构域内的一个此前未被鉴定的位点。定点突变实验表明，CHK2 可能通过磷酸化 HIF-1α 的 Thr645 位点，降低 UPS 降解，从而提高 HIF-1α 的蛋白稳定性。

4. CHK2 诱导的 HIF-1α 磷酸化通过促进与 USP7 的复合物形成增加 HIF-1α 稳定性：去泛素化酶 USP7 在缺氧条件下对 HIF-1α 的去泛素化起重要调节作用。研究发现，CHK2 基因敲除会减弱 HIF-1α 与 USP7 的复合物形成，而过表达 CHK2 则促进二者结合。HIF-1α 在 Thr645 位点的磷酸化是其与 USP7 复合物形成的必要条件，当 Thr645 突变为 A 时，HIF-1α 与 USP7 的结合强度显著减弱，导致 HIF-1α 的泛素化增加。这表明 CHK2 通过促进 HIF-1α 与 USP7 的结合，依赖于 HIF-1α 在 Thr645 位点的磷酸化，增加 HIF-1α 的稳定性。

5. HIF-1α Thr645 位点突变加剧缺氧诱导的细胞凋亡并抑制肿瘤增殖和血管生成：使用 CHK2 抑制剂处理小鼠肿瘤模型，免疫组化分析显示，CHK2 抑制剂组小鼠肿瘤中 CD31 表达显著降低，表明抑制 p-CHK2 可抑制肿瘤血管生成。流式细胞术分析表明，HIF-1α-T645A 转导的 H1299 细胞比 HIF-1α-WT 转导的细胞更容易受到缺氧诱导的细胞凋亡。在体内实验中，HIF-1α-T645A 肿瘤的增殖能力和血管生成能力均低于 HIF-1α-WT 肿瘤。此外，对 50 例 NSCLC 患者组织样本的分析发现，微血管密度与 CHK2 表达之间存在显著相关性。

研究结论和讨论部分指出，CHK2 的表达与人类肿瘤样本的血管生成密切相关。抑制 CHK2 磷酸化可下调 HIF-1α 并抑制血管生成，这为肿瘤进展提供了一种新的机制。研究还发现了一种控制 HIF-1α 蛋白酶体降解的新的翻译后修饰方式，即 CHK2 可在 Thr645 位点磷酸化 HIF-1α，减少其泛素化和降解。HIF-1α Thr645 位点的磷酸化可能是 CHK2 抑制剂疗效的一个有前景的生物标志物，有助于阐明 CHK2 抑制在抗血管生成中的分子作用。此外，敲除 CHK2 可能是解决缺氧介导的治疗耐药性的一种潜在方法，同时靶向缺氧肿瘤细胞并抑制 HIF-1α 磷酸化和血管生成。这项研究为肿瘤治疗提供了新的理论依据和潜在的治疗靶点，有望推动肿瘤治疗领域的进一步发展。