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研究人员为探究 PARP 家族致病机制，利用 TurboID 技术识别其互作蛋白，为相关疾病治疗提供依据。
在生命的微观世界里，细胞活动的调控机制如同精密的时钟，每一个环节都至关重要。聚（ADP - 核糖）聚合酶（PARP）家族便是这个时钟里不可或缺的 “零件”，它们催化 ADP - 核糖单位从 NAD
+转移到靶蛋白（ADP - 核糖基化），在 DNA 修复、基因组稳定性维持和细胞死亡等多种细胞过程中发挥关键作用。长久以来，PARP 家族一直是肿瘤学领域备受瞩目的治疗靶点，PARP 抑制剂已成为治疗多种癌症的重要策略，如胰腺癌、卵巢癌等。不仅如此，近年来的研究还发现，PARP 家族在糖尿病、心血管疾病等非肿瘤疾病中也有着重要影响。
然而，PARP 家族由 17 个成员组成，它们之间的协作机制却如同迷雾，亟待揭开。目前，对 PARP 家族成员的研究存在诸多限制，现有 PARP 抑制剂对不同成员的选择性有限，还会带来不良反应，这暗示着 PARP 家族成员在调节细胞活动时存在集体作用模式。更重要的是，在受控条件下对全部 17 个 PARP 成员进行蛋白质组学分析的研究尚未发表，这严重阻碍了人们对其协作致病作用的理解。
为了攻克这些难题，中山大学孙逸仙纪念医院的研究人员展开了深入探索。他们的研究成果发表在《Scientific Data》上，为 PARP 家族的研究带来了新的曙光。
研究人员采用了 TurboID 技术结合高通量蛋白质组学检测方法，在统一的实验条件下系统地识别了所有 17 个 PARP 成员的相互作用蛋白。TurboID 是一种经过工程改造的生物素连接酶，它能够高效地捕捉传统方法容易忽略的瞬时和弱相互作用。
研究人员用到的主要关键技术方法有：首先是细胞培养与质粒构建，培养 HEK293T 细胞并构建含 V5 - TurboID 或 EGFP 标签的 PARP 质粒；其次是蛋白质表达与富集，转染质粒后培养细胞，进行生物素标记和蛋白质富集；然后通过质谱分析，对富集的蛋白质进行预处理，利用 LC - MS/MS 技术分析肽段，再进行数据处理和统计分析；最后利用多种分析方法，如 Western blotting 验证蛋白表达，荧光显微镜观察亚细胞定位，进行火山图分析、功能注释和富集分析以及构建蛋白互作网络等。
下面来看具体的研究结果：
- 高通量蛋白质组数据：经过一系列复杂的实验操作和数据分析，研究人员最终确定了 6314 个高可信度的相互作用蛋白。这些蛋白的确定为后续研究提供了丰富的数据基础。
- PARP 互作蛋白的验证：
- 蛋白表达和生物素标记效率验证：通过 Western blot 分析，验证了 V5 - TurboID 标记的 PARP 蛋白的表达水平以及生物素标记的效率。结果表明，实验能够成功表达 PARP - TurboID 融合蛋白，并且生物素标记效果良好。
- 质谱数据的统计处理和归一化：对 LC - MS/MS 数据进行了归一化和缺失值插补处理，确保数据的准确性和可靠性。通过严格的筛选标准，确定了显著的 PARP 相互作用蛋白。
- PARP 亚细胞定位保真度验证：利用 EGFP 标记的 PARP 融合蛋白，通过荧光显微镜观察发现不同 PARP 蛋白呈现出不同的亚细胞定位模式，这与它们的生理功能相符，进一步验证了实验结果的可靠性。
- PARP1 和 PARP2 互作组中富集途径的功能验证：对 PARP1 和 PARP2 的互作组进行功能富集分析，发现其相互作用蛋白显著聚集在 DNA 修复、染色质组织和 RNA 加工等关键生物学途径中，这与 PARP1 和 PARP2 的已知功能一致。
- 蛋白 - 蛋白相互作用网络：研究人员构建了蛋白 - 蛋白相互作用网络，直观地展示了 PARP 家族成员之间共享和独特的相互作用蛋白。这个网络为研究 PARP 家族成员的协作和特殊功能提供了全面的视角。
研究结论表明，该研究成功构建了 PARP 家族全面的相互作用组图谱，揭示了 PARP 家族成员之间共享和独特的相互作用蛋白，通过功能注释分析验证了关键生物学过程。这一成果为深入理解 PARP 介导的调控机制奠定了宝贵的基础，也为相关疾病的治疗开发提供了有力支持。同时，研究人员公开了所有原始蛋白质组数据和处理后的相互作用网络，方便其他科研人员进一步研究。未来，基于这些研究成果，有望开发出更具针对性的 PARP 抑制剂，为癌症和其他相关疾病的治疗带来新的突破。
