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为探究 X 连锁 Alport 综合征（XLAS）相关肾病病理机制，研究发现 COL4A5 缺陷激活 HA/CD44/TGFβ 信号促纤维化，为治疗提供新靶点。
X 连锁 Alport 综合征肾纤维化研究：开启新认知，探寻新疗法
在生命的长河中，肾脏犹如一座精密的 “净化工厂”，默默承担着过滤血液、排出废物的重任。然而，有一种名为 X 连锁 Alport 综合征（XLAS）的遗传性疾病，却像潜伏在肾脏中的 “破坏者”，严重威胁着人们的健康。XLAS 由 X 连锁 COL4A5 基因突变引起，超过 80% 的 Alport 综合征病例都与之相关。男性患者由于仅有一份 COL4A5 基因，一旦该基因受损，就极易发展为严重的肾病，甚至在 40 岁前就有高达 90% 的男性会进展到终末期肾病（ESRD），生命健康受到极大威胁。
目前，针对 XLAS 相关肾病的治疗手段十分有限。这是因为其发病的具体分子机制还未完全明晰，尤其是从 COL4A5 功能缺失到肾脏纤维化这一关键病理过程的详细路径，依旧隐藏在重重迷雾之中。肾脏纤维化作为 AS 相关肾病的主要病理特征之一，会导致细胞外基质（ECM）过度增生，进而严重损害肾脏功能。因此，深入探究 XLAS 相关肾病的发病机制，寻找潜在的治疗靶点，成为了医学领域亟待攻克的难题。
为了揭开 XLAS 相关肾病的神秘面纱，深圳妇幼保健院、南方医科大学以及深圳妇幼健康与疾病重点实验室等机构的研究人员，展开了一项意义重大的研究。他们的研究成果发表在《Molecular Medicine》杂志上，为我们理解 XLAS 的发病机制和治疗策略带来了新的曙光。
在这项研究中，研究人员采用了多种关键技术方法。首先，他们运用 RNA 干扰（RNAi）技术，通过设计针对特定基因的小干扰 RNA（siRNA），成功敲低了细胞中 COL4A5 和 CD44 基因的表达，以此来观察基因表达变化对相关通路和蛋白表达的影响。其次，免疫印迹法（Western blot）被用于检测蛋白质的表达水平，帮助研究人员准确分析不同样本中目标蛋白的含量。此外，免疫组化（Immunostaining）技术则让研究人员能够直观地观察到肾脏组织中蛋白的定位和表达情况，为研究提供了有力的组织学证据 。研究中使用的样本来自于前期构建的 Col4a5 突变 C57BL/6 小鼠，这些小鼠高度模拟了 XLAS 的肾脏症状，为研究提供了重要的实验材料。
下面让我们来详细看看研究人员的重要发现：
- CD44 和 TGFβ 在 XLAS 小鼠肾脏中显著上调：研究人员对比了 XLAS 小鼠和健康对照小鼠的肾脏组织，发现 XLAS 小鼠肾脏出现了广泛的纤维化。通过对之前 RNA 测序（RNA-seq）数据的深入分析，他们发现纤维化相关标记基因，如 Col1a1、Col1a2、Col3a1 和 Acta1 等的表达在 XLAS 模型小鼠中明显上调。其中，Cd44 基因的上调最为显著，同时，Tgfβ 的三种转录本 Tgfb1、Tgfb2 和 Tgfb3 的表达也有所增加。进一步通过定量聚合酶链反应（qPCR）和免疫印迹法（WB）验证，证实了 CD44 和 TGFβ 在 Col4a5 小鼠肾脏中的高表达。此外，研究人员还通过细胞实验发现，在人胚胎肾细胞系 HEK-293 中过表达 CD44 可以激活 TGFβ 的表达，而在间充质成纤维细胞系 HEPM 中敲低 CD44 则会显著抑制 TGFβ 的表达。这一系列实验表明，CD44 是参与 Col4a5 突变 XLAS 模型小鼠肾纤维化的关键因素，并且增加的 CD44 可以激活 TGFβ，进而促进肾脏纤维化。
- XLAS 模型小鼠肾脏组织中 HA 水平升高：研究人员对肾脏中的透明质酸（HA）水平进行了检测，结果发现，与健康对照组相比，XLAS 小鼠的肾小球和间质组织中的 HA 水平显著增加。通过超滤技术分离不同分子量的 HA，并进行酶联免疫吸附测定（ELISA）分析，发现 XLAS 小鼠肾脏中总 HA 和低分子量 HA（LMW-HA，<300 kDa）的水平显著上升，而高分子量 HA（HMW-HA，>1000 kDa）水平虽有增加，但与健康对照组相比无显著差异。免疫荧光染色结果也显示，XLAS 小鼠肾脏组织中 CD44 和 HA 的表达均有所增加，且二者的信号在肾小球和间质组织中部分共定位，尤其在肾小管间质组织中 HA 和 CD44 的增加更为明显。这表明在 XLAS 模型小鼠肾脏组织中，总 HA 尤其是 LMW-HA 显著增加，并且积累的 HA 可以与受体 CD44 相互作用并激活它。
- 低分子量 HA 通过 CD44 激活 TGFβ：为了进一步探究 HA 与 CD44、TGFβ 之间的关系，研究人员在 HEK-293 和 HEPM 细胞的培养基中分别添加外源的 LMW-HA 或 HMW-HA。结果发现，LMW-HA 能够显著增加 HEK-293 和 HEPM 细胞中 CD44 和 TGFβ 的蛋白质水平，而 HMW-HA 则对二者的表达没有影响。此外，敲低 CD44 后，LMW-HA 诱导的 CD44 和 TGFβ 的增加被完全消除。这说明 LMW-HA 可以增加 CD44 的表达，并且 LMW-HA 激活 TGFβ 的过程依赖于 CD44，同时也表明 LMW-HA 在表达高水平 CD44 的间充质成纤维细胞中可能更有效地激活 CD44/TGFβ 信号通路。
- Col4a5 缺陷增加 HAS2 表达：由于 HA 由透明质酸合酶（HAS）合成，研究人员对 HAS 的表达水平进行了研究。通过 RNA 测序发现，在 Col4a5 突变的 XLAS 模型小鼠中，HAS1 和 HAS2 的表达水平升高，但 HAS3 的表达未发生明显变化。在人胚肾细胞系 HEK-293 中通过 RNAi 技术敲低 COL4A5 后，发现 HAS2 的 mRNA 和蛋白质水平均显著增加，而 HAS1 的 mRNA 水平虽有所上升但差异不显著，HAS3 的表达基本不变。免疫染色实验也证实，与健康组织相比，XLAS 小鼠肾脏组织中的肾小球和间质小管中 HAS2 的表达明显增加。这表明 COL4A5 缺陷可能导致 HAS2 的过表达，进而促进 HA 的产生，这可能是 HA 早期积累并激活 HA/CD44/TGFβ 信号通路，最终促进纤维化的重要原因。
综合上述研究结果，研究人员认为 COL4A5 缺陷可能导致 HAS2 过表达，使得细胞外基质中 LMW-HA 水平增加。这些增加的 HA 作为 “信使”，激活了在成纤维细胞或其他肾间质微环境中高表达的 CD44 分子，进而激活 TGFβ 信号通路，最终促进了肾脏纤维化。这一发现揭示了 XLAS 肾纤维化的新机制，为理解 XLAS 的发病过程提供了重要线索。同时，研究还表明 HAS2 和 CD44 有可能成为治疗 XLAS 相关肾纤维化的潜在靶点，为开发新的治疗策略提供了理论依据。
然而，这项研究也存在一定的局限性。研究仅使用了收集的肾脏组织，缺乏活体模型小鼠的实验，而且肾脏组织仅来源于雄性小鼠，样本量较小。此外，用于实验的 HEK-293 和 HEPM 细胞并不能完全代表特定类型的肾脏细胞，并且 Col4a5 缺失与 HAS2 过表达之间的分子联系仍有待进一步探索。尽管如此，该研究依然为 XLAS 相关肾病的研究开辟了新的方向。未来，研究人员需要开展更多的研究来克服这些局限性，如在活体小鼠中进行拯救实验，比较 HAS2/HA - CD44 抑制疗法与目前常用的肾素 - 血管紧张素 - 醛固酮系统（RAAS）阻滞剂的治疗效果，以及确定 COL4A5 缺陷激活的 HA/CD44/TGFβ 通路是否在 Col4a3 或 Col4a4 缺陷小鼠中同样存在等。相信随着研究的不断深入，我们对 XLAS 的认识将更加全面，未来有望为 XLAS 患者带来更有效的治疗方法，帮助他们摆脱疾病的困扰，重获健康生活。
