靶向和非靶向蛋白质组学比较腺病毒感染的 hCMEC/D3 和 hBMEC 用于研究 OATP2B1 转运体

为研究血脑屏障（BBB）中 OATP2B1 转运体，研究人员对比分析腺病毒感染的 hCMEC/D3 和 hBMEC，揭示细胞模型特性。

　　在人体的神经系统中，血脑屏障（Blood-Brain Barrier，BBB）就像一道精密的 “防火墙”，守护着中枢神经系统（Central Nervous System，CNS）的稳定。它严格把控着血液和大脑之间物质的进出，对维持大脑内环境的稳定起着至关重要的作用。在这道屏障中，存在着各种各样的膜转运蛋白，它们如同一个个 “运输小卫士”，其中有机阴离子转运多肽（Organic Anion-Transporting Polypeptides，OATPs）家族的 OATP2B1 转运体备受关注。研究发现，OATP2B1 在人体内的血脑屏障上有表达，可能参与他汀类药物和神经甾体的摄取过程，但由于动物模型中血脑屏障缺乏 OATP2B1 表达，且现有的体外血脑屏障模型存在局限性，无法完全模拟体内转运体的真实表达情况，导致其在血脑屏障中的具体功能一直不明确。

为了深入了解 OATP2B1 转运体在血脑屏障中的作用，来自瑞士巴塞尔大学药学院等机构的研究人员展开了一项重要研究，相关成果发表在《Molecular Neurobiology》杂志上。

在这项研究中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先是细胞培养技术，他们培养了人永生化脑微血管内皮细胞系 hCMEC/D3 和 hBMEC；其次是腺病毒感染技术，用 Ad-OATP2B1 或 Ad-LacZ 感染细胞；然后是蛋白质组学技术，包括基于液相色谱 - 串联质谱（LC-MS/MS）的靶向蛋白质组学和非靶向蛋白质组学分析，以此来检测蛋白质的表达水平 。

研究人员首先对腺病毒感染的 hCMEC/D3 和 hBMEC 中 BBB 标记物进行绝对定量分析。通过靶向蛋白质组学发现，内皮标记物 PECAM1 和 CDH5 仅在 hCMEC/D3 中可检测到，且 Ad-LacZ 和 Ad-OATP2B1 感染的 hCMEC/D3 细胞中这两种标记物的蛋白质丰度相当；紧密连接蛋白 OCLN 的蛋白表达仅在 hBMEC 中高于定量下限（Lower Limit of Quantification，LLOQ）；BBB 受体 TFRC 在 hCMEC/D3 和 hBMEC 中的表达不受腺病毒感染影响且水平相当；同时，研究人员还评估了Na+/K+-ATPase 作为对照。

接着，研究人员对 hCMEC/D3 和 hBMEC 中的外排转运体进行靶向蛋白质组学定量分析。结果显示，Pgp 在 hCMEC/D3 和 hBMEC 中的丰度不受腺病毒感染影响且水平相当；BCRP 仅在 hBMEC 中可检测到，在 hCMEC/D3 中低于 LLOQ；MRP1 和 MRP4 在两种细胞系中的蛋白丰度在不同感染条件下无差异。

在对 SLC 转运体的靶向蛋白质组学分析中，研究人员发现 GLUT1、ENT1 和 MCT1 在 hCMEC/D3 和 hBMEC 中的表达不受腺病毒感染影响且水平相当；OAT7 在两种细胞系中的表达相似；而 OAT2、OAT3、OCT1、OCT3 和 OATP1A2 在两种细胞系中的表达均低于 LLOQ 或无法检测到。尽管之前通过 Western blot 分析证实腺病毒感染后两种细胞系中 OATP2B1 表达增加，但此次靶向蛋白质组学分析中，两种细胞系中 OATP2B1 的丰度均低于 LLOQ。

为了更全面地了解两种细胞系，研究人员进行了非靶向蛋白质组学分析。在 hCMEC/D3 中，Ad-LacZ 和 Ad-OATP2B1 感染细胞的蛋白质水平变化较小，而在 hBMEC 中变化较大，主要涉及细胞周期、腺病毒感染和 DNA 修饰相关蛋白。分析还表明，Ad-OATP2B1 感染增加了两种细胞系中 OATP2B1 的表达，但对 BBB 标记物、ABC 和 SLC 转运体的表达无影响，且 hBMEC 中 Ad-OATP2B1 感染后 OATP2B1 水平变化具有统计学意义。

通过非靶向蛋白质组学对 Ad-OATP2B1 感染的 hCMEC/D3 和 hBMEC 进行比较发现，两种细胞系虽有 6498 种共享蛋白质，但仍有多种蛋白质表达存在差异。hCMEC/D3 Ad-OATP2B1 中 BBB 标记物 B2M、PECAM1、CDH5、FCGRT、LDLR 和 VLDLR 的蛋白质表达更高；ABC 转运体 Pgp 和 MRP1 在 hCMEC/D3 Ad-OATP2B1 中表达增强，而 ABC50 在 hBMEC Ad-OATP2B1 中水平升高；多种 SLC 转运体在 hCMEC/D3 Ad-OATP2B1 中表达更高，hBMEC Ad-OATP2B1 中仅 OATP4A1、S22AI 和 ZIP8 表达升高，且 hBMEC Ad-OATP2B1 中 OATP2B1 表达虽无统计学意义，但高于 hCMEC/D3 Ad-OATP2B1。

综合研究结果和讨论部分，这项研究对 Ad-OATP2B1 感染的 hCMEC/D3 和 hBMEC 作为体外人脑内皮细胞模型用于研究 OATP2B1 转运体的适用性进行了深入分析。研究发现两种细胞系在 BBB 标记物、转运体表达等方面存在差异，hCMEC/D3 具有更坚实的 BBB 表型，可用于研究内源性表达转运体的功能，但存在细胞单层渗漏的问题；hBMEC 细胞层更紧密，可用于预测化合物在血脑屏障的通透性。同时，研究还揭示了靶向和非靶向蛋白质组学在检测蛋白质表达水平上的差异及原因，强调了采用多种方法验证蛋白质表达的重要性。这一研究为后续血脑屏障相关研究在细胞模型选择、蛋白质检测方法等方面提供了重要参考，有助于更深入地探究血脑屏障的功能及药物转运机制，推动相关领域的发展。