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为探究 NOTCH3 变异位置对 CADASIL 疾病严重程度的影响，研究人员利用 hiPSCs 展开研究，证实两者存在关联。
在神秘的人体微观世界里，脑血管疾病一直是威胁人类健康的重要隐患。其中，脑常染色体显性动脉病伴皮质下梗死和白质脑病（Cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy，CADASIL）是一种罕见且严重的脑血管疾病，它与 NOTCH3 基因突变紧密相关。
CADASIL 的患者会出现广泛的白质高信号（white matter hyperintensities，WMHs）、复发性小的深部脑梗死、认知能力下降、运动障碍和精神障碍等症状。此前研究发现，NOTCH3 基因中表皮生长因子样重复（epidermal growth factor - like repeat，EGFr）结构域 1 - 6 的半胱氨酸突变，与更严重的临床和影像学特征以及血管壁中更高的 Notch3 积累有关；而 EGFr 结构域 7 - 34 的突变则与较晚的中风发作和更长的生存期相关。然而，NOTCH3 变异位置是否直接影响 CADASIL 的严重程度，这一问题在医学界仍存在诸多争议，多数患者的表型变异性也尚不明确。
为了深入探索这一谜题，来自西班牙多家研究机构的研究人员展开了一项极具意义的研究。他们的研究成果发表在《NeuroMolecular Medicine》上。
研究人员采用了多种关键技术方法。在样本方面，前瞻性招募了 4 名 CADASIL 患者和 2 名对照志愿者，其中患者分别来自 Hospital Univeristario Vall d′Hebron 和 Hospital Clínico Universitario of Santiago de Compostela。从他们的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中，利用非整合型仙台病毒（Sendai virus，SeV）重编程技术生成人类诱导多能干细胞（human - induced pluripotent stem cells，hiPSCs）。之后，对生成的 hiPSCs 进行了一系列标准化测试，包括核型分析、NOTCH3 突变基因的桑格测序、短串联重复序列（short tandem repeats，STRs）分析、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）活性分析、多能性标记物分析以及向三个胚层分化能力的分析。同时，还对细胞的 Notch3 蛋白积累情况和蛋白质组进行了分析，并运用相关软件进行数据处理和统计分析。
研究结果主要包括以下几个方面：
- 患者临床特征：4 名 CADASIL 患者中，EGFr 1 - 6 致病性变异的患者在磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）扫描中表现出症状性缺血性中风、广泛的 WMHs、多发性腔隙和微出血；而 EGFr 7 - 34 致病性变异的患者在 MRI 扫描中未出现中风和腔隙。
- hiPSCs 的特征：研究生成了 6 个细胞系（4 个来自 CADASIL 患者，2 个来自健康供体）。核型分析证实重编程过程未改变染色体的数量和结构；桑格测序表明 SeV 重编程过程未影响 NOTCH3 突变序列；STRs 分析验证了 hiPSCs 与原始 PBMCs 的匹配性；免疫细胞化学分析显示，生成的 hiPSCs 系与对照受试者的 hiPSCs 在 AP 和多能性标记物（OCT4、SOX2、SSEA4 和 TRA1 - 60）的表达模式相似；6 个细胞系均成功分化为三个胚层。
- Notch3 积累情况：通过酶联免疫吸附测定（enzyme - linked immunosorbent assay，ELISA）分析发现，CADASIL 患者 hiPSCs 系中的 Notch3 蛋白水平高于对照组，且 EGFr 1 - 6 变异组差异显著。免疫细胞化学分析显示，EGFr 1 - 6 变异组的细胞系中，Notch 细胞内结构域（Notch intracellular domain，NICD）和 Notch 细胞外结构域（Notch extracellular domain，NECD）的免疫染色积累均高于 EGFr 7 - 34 变异组和对照组细胞系。
- 蛋白质组分析：定性蛋白质组分析中，数据依赖采集（data - dependent acquisition，DDA）分析发现 298 种仅在 CADASIL 样本中存在的蛋白质，这些蛋白质与细胞骨架重组过程、细丝组织和超分子纤维组织有关。功能富集分析表明，CADASIL 组与对照组相比，收缩抑制机制降低，与血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）相关的收缩和过程的正向调节降低，细胞骨架重组、血管生成的负调节和自噬过程增强。进一步比较两个 CADASIL 组，发现 161 种共同蛋白质，EGFr 1 - 6 变异组有 25 种特异性蛋白质，涉及细胞结构和维持以及细胞骨架形成；EGFr 7 - 34 变异组有 88 种特异性蛋白质，与钙粘蛋白结合、细胞骨架稳定性和细胞凝聚力高度相关。定量蛋白质组分析中，通过顺序窗口采集所有理论质谱（sequential window acquisition of all theoretical mass spectra，SWATH - MS）分析，在 EGFr 1 - 6 变异组与对照组比较中，发现 64 种失调蛋白质，涉及钙粘蛋白结合、细胞结构维持和神经退行性过程相关的代谢途径；EGFr 7 - 34 变异组与对照组比较中，发现 85 种失调蛋白质，涉及钙粘蛋白结合和细胞粘附；EGFr 1 - 6 与 EGFr 7 - 34 变异组比较中，发现 49 种失调蛋白质，涉及细胞组织、保护和粘附途径以及细胞外基质形成和细胞骨架重组。其中，波形蛋白（vimentin）在 EGFr 1 - 6 CADASIL 组中显著失调，ELISA 验证也显示 EGFr 1 - 6 变异组与对照组之间存在显著差异。
研究结论和讨论部分指出，该研究首次通过实验评估了 NOTCH3 致病性基因变异与 CADASIL 严重程度之间的临床关联。研究发现 EGFr 1 - 6 致病性基因变异与细胞骨架重组机制改变和 Notch3 表达水平升高有关，这与临床中 NOTCH3 变异位置与 CADASIL 严重程度的关联相符合。然而，研究也存在一些局限性，如对照受试者未与 CADASIL 患者进行年龄匹配，未使用更合适的同基因人类 iPSCs 作为对照，样本量较小等。未来的研究需要进一步扩大样本量，研究 hiPSCs 向 VSMCs 的分化，以确定不同致病性基因变异之间 Notch3 在血管病理积累上的差异。
总的来说，这项研究为深入理解 CADASIL 的发病机制提供了重要依据，有助于开发更有效的诊断和治疗方法，为 CADASIL 患者带来新的希望。
