二肽基肽酶DPF-3：动物microRNA Argonaute补偿机制的关键调控因子

《Nature Communications》最新研究揭示，加拿大拉瓦尔大学Martin J. Simard团队发现二肽基肽酶DPF-3通过调控ALG-2蛋白水平，在秀丽隐杆线虫中建立microRNA Argonaute（AGO）的补偿机制。该研究运用IP-MS、TAILS和CRISPR-Cas9等技术，证实DPF-3缺失可显著提升ALG-2介导的miRISC形成效率，挽救alg-1缺失导致的发育缺陷。这一发现为理解多AGO物种中微小RNA通路调控提供了新视角，对肿瘤生物学和发育障碍研究具有重要启示意义。

　　

在生命调控的精密网络中，microRNA（miRNA）如同分子世界的微型开关，通过调控基因表达参与发育、衰老等关键生物学过程。这些长约22个核苷酸的小RNA需要与Argonaute（AGO）蛋白家族成员结合形成miRNA诱导的沉默复合体（miRISC）才能发挥作用。有趣的是，包括人类和秀丽隐杆线虫在内的许多生物都拥有多个miRNA特异性AGO同源蛋白，这些高度相似的蛋白如何分工协作？为何在某些条件下一种AGO能补偿另一种的功能缺失？这些谜题长期困扰着科学家。

加拿大拉瓦尔大学Louis-Mathieu Harvey、Pierre-Marc Frédérick与Martin J. Simard领衔的研究团队在《Nature Communications》发表突破性成果。研究人员以经典模式生物秀丽隐杆线虫为研究对象，发现二肽基肽酶DPF-3作为miRNA特异性AGO ALG-1的相互作用蛋白，在调控ALG-2补偿功能中扮演关键角色。这项研究不仅揭示了AGO蛋白动态平衡的新机制，更为理解多AGO物种中miRNA通路的精细调控提供了重要线索。

研究团队采用多组学联用策略展开探索：通过ALG-1免疫沉淀结合质谱分析（IP-MS）鉴定出DPF-3为ALG-1新型互作蛋白；利用CRISPR-Cas9构建dpf-3敲除株与alg-1功能缺失株的复合突变体；采用小RNA测序和RT-qPCR分析miRNA及其靶标表达谱；结合TAILS（末端胺同位素标记）技术和LC-MS/MS检测ALG-2蛋白N端加工；开发V5标签内源标记ALG-2系统研究蛋白互作；建立2'-O-甲基化pull-down技术特异性富集let-7和miR-77 miRISC复合物。

"DPF-3是ALG-1的物理和遗传互作因子"部分揭示，IP-MS分析在ALG-1复合物中意外捕获到DPF-3，且该互作不依赖RNA存在。遗传学实验显示，dpf-3缺失可显著挽救alg-1突变体的三大典型表型：体壁细胞增殖异常、角质层alae结构缺陷和成虫期外阴爆裂，证实二者存在功能关联。

"DPF-3缺失恢复alg-1功能缺失动物的正常miRNA抑制"章节通过小RNA测序发现，dpf-3;alg-1双突变体中73.3%在alg-1单突变中失调的miRNA恢复至野生型水平。特别是let-7家族成员及其靶基因（DAF-12和HBL-1）的表达调控在双突变体中完全恢复正常，说明DPF-3缺失能重建有效的miRNA介导基因沉默。

"DPF-3耗竭增加ALG-2功能性miRISC"部分展示关键机制：Western blot显示双突变体ALG-2蛋白水平显著升高；特异性miRISC纯化实验证实let-7和miR-77与ALG-2的结合增强。ALG-2 RNAi实验证明该蛋白对表型挽救不可或缺，而dpf-3与alg-2双突变未显示协同效应，表明DPF-3的调控具有ALG-1依赖性。

关于"DPF-3二肽酶活性不参与ALG-2调控"的发现尤为意外：虽然体外实验证实DPF-3能切割ALG-2 N端二肽（需Pro位于第二位），但体内实验显示催化突变体DPF-3(S784A)和ALG-2 Pro突变体均不能重现dpf-3缺失的表型挽救效果。TAILS分析也未检测到内源性ALG-2 N端加工，暗示DPF-3可能通过非催化机制调控ALG-2。

后续研究发现"DPF-3不与ALG-2稳定结合"。通过巧妙设计V5标签内源标记ALG-2（避开N端干扰），免疫共沉淀结合质谱分析证实DPF-3仅与ALG-1形成稳定复合物。这一结果解释了为何DPF-3对ALG-2的调控需要alg-1缺失的背景。

最终，"alg-1(gk214)背景下DPF-3缺失导致ALG-2 mRNA增加"揭示了转录水平调控机制：RT-qPCR显示双突变体ALG-2前体mRNA增加1.5倍，成熟mRNA水平相应提升。这种效应具有基因特异性，暗示DPF-3可能通过间接调控RNA加工因子影响ALG-2表达。

这项研究构建了全新的调控模型：在正常情况下，DPF-3通过与ALG-1互作维持miRNA通路稳态；当ALG-1缺失时，DPF-3限制ALG-2 mRNA加工从而抑制其补偿功能；去除DPF-3则解除这种抑制，使ALG-2通过增加表达和miRISC组装来完全补偿ALG-1缺失。该发现不仅阐明了多AGO系统中功能补偿的分子开关，更暗示哺乳动物DPP8/9可能具有类似调控功能。鉴于DPP家族在肿瘤和免疫中的重要作用，这项研究为相关疾病治疗提供了新的靶点思路。