CdeR：调控 Dickeya dadantii 致病力的关键 “分子开关”

本文揭示了 Dickeya dadantii 中 CdeR 调控 III 型分泌系统（T3SS）的机制，为防治软腐病提供新思路。

　　

一、研究背景

Dickeya dadantii 是一种能引发多种植物软腐病、枯萎病和疫病的细菌病原体，广泛分布于植物表面、土壤及水涝环境，给病害防治带来极大挑战。其致病性依赖于细胞壁降解酶和 III 型分泌系统（T3SS），T3SS 可将细菌效应蛋白注入宿主细胞，有效调节宿主防御反应，助力细菌定植。

T3SS 的调控十分复杂，涉及至少两个双组份系统（TCSs）：HrpX/HrpY 和 GacA/GacS。在转录水平，HrpX/HrpY 通过上调 hrpL 转录激活 T3SS 表达，hrpL 转录又受 RpoN（σ⁵⁴）和增强子结合蛋白 HrpS 的刺激。此外，RsmA/rsmB 系统对 hrpL 转录后调控也发挥重要作用。

细菌第二信使环二鸟苷酸（c-di-GMP）作为全局信号分子，通过多种相关组分调节 T3SS 表达。细胞内 c-di-GMP 水平由鸟苷酸环化酶（DGCs）和磷酸二酯酶（PDEs）控制，DGCs 负责合成 c-di-GMP，PDEs 则将其分解。c-di-GMP 可与多种效应物结合，调控细胞特定反应。

转录因子依据 DNA 结合结构域的结构特征分类，原核生物中最丰富的 DNA 结合结构域是螺旋 - 转角 - 螺旋（HTH）结构域。在 Dickeya dadantii 中已鉴定出多个转录因子家族，它们控制着众多启动子的活性。

二、研究结果

1. GcpD 负调控 T3SS 基因表达：GcpD 是一种假定的 DGC，与 GcpA 有相似的 N 端感觉结构域。研究发现，gcpD 缺失突变体中 hrpA 和 hrpN 启动子活性显著增加，互补实验恢复了野生型表型。进一步研究表明，GcpD 可能通过转录后调节 RpoN，进而控制 T3SS 主调节因子 HrpL，影响 T3SS 基因表达。
2. GcpD 的 DGC 活性对 T3SS 调控至关重要：通过超高效液相色谱 - 串联质谱（UPLC-MS/MS）检测发现，gcpD 过表达菌株中 c-di-GMP 浓度约为野生型的三倍，而 ΔgcpD 突变体中 c-di-GMP 水平显著低于野生型，表明 GcpD 是合成 c-di-GMP 的 DGC。将 GcpD 的 GGDEF 结构域中关键天冬氨酸残基替换为丙氨酸（gcpD^D525A）后，无法恢复 ΔgcpD 中 hrpA 启动子活性，且不能使 c-di-GMP 水平恢复到野生型，证明 GcpD 的 c-di-GMP 产生活性对 T3SS 调控至关重要。
3. 转座子诱变鉴定出 CdeR 为 T3SS 调节因子：在 ΔgcpD 中进行转座子诱变筛选，发现插入 ABF-0020041（后命名为 CdeR）编码的假定 DNA 结合转录调节因子开放阅读框，会显著降低 hrpA 表达。在野生型和 ΔgcpD 背景下分别删除 cdeR，结果显示，虽然野生型和 ΔcdeR 之间 hrpA 启动子活性无显著差异，但 ΔgcpDΔcdeR 中 hrpA 启动子活性和 RNA 水平相较于 ΔgcpD 降低，互补实验可使表型恢复。此外，ΔgcpDΔcdeR 中 hrpN 启动子活性和蛋白水平也显著下降。进一步研究发现，CdeR 在缺乏 gcpD 时正向调节 T3SS，涉及 HrpL 和 HrpS，但不涉及 RpoN。
4. CdeR 通过调节 c-di-GMP 水平调控 ΔgcpD 中的 T3SS：使用 c-di-GMP 报告基因检测发现，在 ΔgcpD 中删除 cdeR 可使 c-di-GMP 水平恢复到野生型，且能被 cdeR 的反式表达互补。通过 RT-qPCR 检测发现，ΔgcpDΔcdeR 中 gcpL RNA 水平相较于 ΔgcpD 增加约四倍，表明 CdeR 抑制 gcpL 表达。删除 gcpL 会降低 ΔgcpDΔcdeR 中的 c-di-GMP 水平，增加 hrpA 启动子活性。此外，过表达 PDE 编码基因 egcpB 可使 ΔcdeRΔgcpD 中的 c-di-GMP 水平和 hrpA 表达恢复到接近 ΔgcpD 的水平。这些结果表明，CdeR 通过抑制 gcpL 表达正向调节 T3SS，且低 c-di-GMP 水平可能是 CdeR 调节 GcpL 所必需的。
5. CdeR 以 c-di-GMP 依赖的方式控制细菌运动、pelD 基因表达和马铃薯浸软：研究发现，ΔgcpDΔcdeR 中 pelD 启动子活性相较于 ΔgcpD 显著降低，而单独删除 cdeR 对野生型细菌的 pelD 启动子活性影响可忽略不计，表明 CdeR 仅在 gcpD 缺失时正向调节 pelD 基因表达。删除 gcpD 会增强细菌游泳运动能力和马铃薯块茎浸软面积，删除 cdeR 可使这些表型恢复到野生型水平，互补实验则恢复到 ΔgcpD 水平。此外，删除 gcpL 会增加 ΔgcpDΔcdeR 的游泳运动能力，但不影响 pelD 表达，说明 CdeR 通过 GcpL 调节 c-di-GMP 水平控制细菌运动，而其对 pelD 基因表达的调控不涉及 GcpL。
6. CdeR 的 DNA 结合结构域对其功能至关重要：序列比对分析显示，CdeR 与已知 DNA 结合蛋白 Ner 和 Nlp 有较高的氨基酸序列同一性，均含有 HTH DNA 结合结构域。研究发现，缺失 HTH 区域的 CdeR 衍生物无法增加 ΔgcpDΔcdeR 中 hrpA 基因表达，对游泳运动能力也有类似影响，且这些衍生物的稳定性得到确认，表明 CdeR 是潜在的 DNA 结合蛋白，HTH 区域对其生物学功能必不可少。

三、研究讨论

本研究首次证明 DGC GcpD 以 c-di-GMP 依赖的方式抑制 Dickeya dadantii 中 T3SS 基因表达，其调控机制可能涉及 RpoN-HrpS-HrpL 途径。转座子诱变确定 CdeR 是 GcpD 介导的 T3SS 调控中的关键因子，CdeR 仅在 gcpD 突变背景下调节 T3SS，该过程涉及另一个 DGC GcpL，且可能独立于 RpoN。

不同 c-di-GMP 信号通路对 T3SS 的调控存在层次差异。GcpD 可能与 EGcpB 和 EcpC 共同转录调节 HrpL，而 GcpA 通过调节 RsmA/rsmB 系统微调 hrpL mRNA 稳定性。

CdeR 在 c-di-GMP 信号传导中表现出独特性，其功能仅在缺乏 GcpD 时发挥作用，与其他细菌中 c-di-GMP 相关转录调节因子的功能类似。然而，CdeR 是否直接结合 c-di-GMP，以及 GcpD 与 CdeR 之间是否存在直接相互作用仍有待研究。

虽然 CdeR 对 T3SS 调控至关重要，但它如何控制 T3SS 调节子基因的表达尚不清楚。研究表明 SlyA 不太可能在 CdeR 介导的 T3SS 调控中起关键作用，而 HTH 区域对 CdeR 的生物学功能至关重要。CdeR 是否直接与 T3SS 调节子相互作用，以及是否存在其他与 c-di-GMP 相关的调节因子，仍需进一步研究。

研究还发现，ΔgcpDΔcdeR 中 c-di-GMP 水平恢复到野生型是由于 gcpL 表达增加。存在两种不同的 c-di-GMP 信号通路分别控制 T3SS 和细菌运动，而 CdeR 对 pelD 表达的调控机制独立于 GcpL。

本研究揭示了 CdeR 在低 c-di-GMP 水平条件下对 T3SS 基因表达的正向作用，并提出了 CdeR 与 c-di-GMP 信号在调节 T3SS、游泳运动和 Pel 产生中的相互作用模型，有助于深入理解细菌如何响应环境变化调节行为和毒力。

四、研究方法

1. 细菌菌株、质粒、引物和培养：本研究使用了多种 Dickeya dadantii 和 Escherichia coli 菌株，以及多种质粒。Dickeya dadantii 菌株在 LB、MG 或低营养 T3SS 诱导基本培养基（MM）中于 28°C 培养，Escherichia coli 菌株在 LB 培养基中于 37°C 培养。根据实验需求添加相应抗生素。
2. 突变体构建和互补：通过标记交换诱变构建 ΔcdeR 突变体，利用 pFLP2 质粒编码的 FLP 重组酶构建双突变体和三突变体。将目标基因的启动子和开放阅读框区域 PCR 扩增后插入低拷贝数质粒 pCL1920 构建互补菌株。
3. GFP 报告质粒构建和流式细胞术检测：将目标基因的启动子区域和部分开放阅读框 PCR 扩增后克隆到 pPROBE-AT 载体构建报告质粒。细菌培养后收集样本，用流式细胞术检测平均荧光强度（MFI），以评估启动子活性。
4. 蛋白质免疫印迹分析：将 Dickeya dadantii 细胞培养后裂解，定量蛋白质，进行 SDS-PAGE 电泳，转膜后用相应抗体检测目标蛋白。
5. 逆转录（RT）和定量 RT-PCR（RT-qPCR）分析：提取细菌总 RNA，进行 DNase 处理后合成 cDNA，使用 qRT-PCR 反应定量目标基因的 cDNA 水平，以 rplU 作为内参。
6. 细胞内 c-di-GMP 浓度测定：使用 UPLC-MS/MS 和 GUS 报告基因检测两种方法测定细胞内 c-di-GMP 浓度。
7. 游泳运动能力检测：将过夜培养的细菌接种到含 0.2% 琼脂的 MG 平板上，培养后测量径向生长直径评估游泳运动能力。
8. Pel 活性检测：通过光谱法检测细胞外 Pel 活性。
9. 毒力检测：用马铃薯块茎进行浸软实验评估 Dickeya dadantii 的毒力。
10. 定点突变构建：克隆 gcpD 和 cdeR 全长到 pCL1920 质粒，通过重叠延伸 PCR 产生定点突变，测序确认后导入相应菌株。
11. 统计分析：使用 SPSS 25 软件进行均值和标准差计算，采用 Student’s t 检验或单因素方差分析（one-way ANOVA）及事后 Tukey HSD 检验进行统计分析。}