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本文介绍了用几何活力测定法（GVA）检测厌氧细菌活力的新方法，高效且经济。
厌氧细菌活力检测的困境与新探索
在生命科学和健康医学领域，厌氧细菌是人类和动物微生物群的重要组成部分，其中部分机会致病菌引发的感染严重，死亡率高。以产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）为例，它广泛存在于土壤、食物、灰尘及人和动物肠道中，其毒素能引发多种疾病，在美国每年导致约 100 万例食源性疾病，经济损失达 3.84 亿美元 。产气荚膜梭菌可在食物中快速增殖，还能产生耐热、耐化学物质等的孢子，准确快速检测其细胞和孢子对保障食品安全和感染诊断至关重要。
传统基于培养的细菌活力检测方法，如琼脂平板菌落形成单位（CFU）测定法，在厌氧细菌研究中应用广泛，但存在诸多弊端。该方法耗时久、劳动强度大，且需要大量耗材，如琼脂平板、固体和液体培养基、稀释容器及塑料涂布器等，难以满足高通量检测需求。此外，厌氧培养的复杂性也限制了其在高通量活力研究中的应用。
抗生素敏感性测试（AST）对于确定有效抗生素浓度和细菌耐药模式至关重要，但现有针对厌氧菌的 AST 方法存在局限性。基于肉汤浊度的检测方法（如肉汤微量稀释法）结果与传统平板琼脂稀释法不一致，且光密度（OD）值与细菌绝对数量不一定相关，药物本身颜色也会干扰光学检测。对于产芽孢和产毒素的厌氧菌，检测抗生素杀菌效果尤为重要，否则易误判细菌敏感性，因此急需一种高通量方法来量化抗生素活性，以提高检测异质性耐药 / 耐受细菌亚群的分辨率。
在厌氧菌培养方面，常用的厌氧罐和厌氧培养箱各有优缺点。厌氧培养箱虽可大规模培养，但维护成本高、需专业培训、占用空间大且移动不便；厌氧罐虽在便携性、尺寸和二氧化碳生成方面更便利，但培养样本数量受限。同时，当前细菌孢子计数方法，如传统平板计数和显微镜检查，存在劳动强度大、耗时久、易受人为误差影响等问题，无法满足现代微生物学研究的高通量需求，尤其是针对厌氧菌。
几何活力测定法（GVA）的创新实践
鉴于上述问题，研究人员开发了一种新的几何活力测定法（GVA），并将其应用于厌氧菌活力检测，以产气荚膜梭菌为模型展开研究。
建立厌氧 GVA 检测产气荚膜梭菌活力的实验方案
研究人员对 GVA 方法进行改进，使其适用于厌氧环境下检测产气荚膜梭菌的活力。具体操作如下：首先准备包埋溶液，将琼脂糖在硫乙醇酸盐肉汤（TGB）培养基中加热溶解至质量体积比为 0.66%，冷却至 50°C；接着将细菌样本稀释至 96 孔板中，确保预期最大 CFU/mL<107 ；然后将稀释后的样本与包埋溶液混合，使琼脂糖在移液器吸头内凝固。整个过程中，处理一个 96 孔板约需 30 分钟，后续每个板额外耗时 5 分钟。处理好的吸头放入厌氧罐中过夜培养，培养后可清晰观察到吸头内的菌落。
在染色方面，原 GVA 协议推荐的氯化三苯基四氮唑（TTC）无法对产气荚膜梭菌菌落染色，研究人员发现溴甲酚绿（BG）可将细菌菌落染成蓝色，与无色背景形成鲜明对比，且添加 BG 有助于肉眼定性判断药物的最低杀菌浓度（MBC），若仅检测 MBC，可省略细菌稀释步骤，进一步缩短实验时间。
在成像环节，研究人员尝试了多种方法。最初使用无反相机系统，本研究还探索了 GelDoc/ChemiDoc 成像系统。将 12 个吸头放置在白色托盘上，使用 White Trans 照明模式和 590/110 滤光片可实现最佳成像效果。为使 GelDoc 图像能与现有 GVA 软件兼容，研究人员还开发了定制的 MATLAB 脚本。
GVA 活力测量与传统斑点平板法的比较
研究人员通过实验测试了 GVA 对产气荚膜梭菌过夜培养物系列稀释液中 CFU/mL 的定量能力，并与传统斑点平板法进行对比。结果显示，GVA 能在 5 个数量级内线性检测产气荚膜梭菌 4 倍稀释系列的活力，其动态范围比斑点平板法大 2 个数量级。两种方法的活力测量结果显著相关（皮尔逊相关系数r = 0.98，P = 9.5×10?6） 。Bland - Altman 测试表明，在 4 个数量级内，斑点平板法和 GVA 活力测量的偏差为 1.38（100.14），且两种方法差异的趋势线斜率与零无显著差异（P值 = 0.092），说明 GVA 和斑点平板法可互换使用。此外，GVA 测量的技术噪声（通过变异系数 CV 计算）在所有测量的 CFU 浓度下均≤5% 。研究还发现，TGB 培养基在使用 GelDoc 成像时优于 TSC 培养基，因为 TSC 培养基中的硫化亚铁扩散会遮挡菌落。同时，GVA 对其他梭菌属细菌（如双发酵梭菌和生孢梭菌）的活力检测也取得了成功。
GVA 对产气荚膜梭菌孢子形成的检测
研究人员利用 GVA 研究了四种产气荚膜梭菌临床分离株（CP1802、AN3、AN9 和 AN10）的孢子形成能力。先使用 GVA 方法对热激处理前的营养细胞进行定量，热激处理后，同时用平板法和 GVA 对孢子形成的培养物进行检测。结果显示，对于这四种测试分离株，平板法和 GVA 对 CFU 的定量结果无显著差异。
GVA 量化抗生素对产气荚膜梭菌的杀菌效果
研究人员进一步探究了 GVA 在测量不同抗生素作用下产气荚膜梭菌活力方面的应用。用氨苄西林、庆大霉素、美罗培南和四环素四种抗生素处理产气荚膜梭菌临床分离株 CP1802 20 小时后，通过 GVA 量化其活力，并与 OD 测量确定的最低抑菌浓度（MIC）值进行比较。结果发现，氨苄西林、庆大霉素和美罗培南的 MIC 和 MBC 相等，而四环素的 MBC 和 MIC 不同，分别为 125mg/L 和 31.2mg/L，相差 4 倍。GVA 检测到能在 2 倍四环素 MIC 浓度下存活 20 小时的产气荚膜梭菌细胞比例为 1:100,000，这种罕见细胞只有通过像 GVA 这样具有大动态范围的活力检测方法才能观察到。虽然 OD 和活力测量的相关系数较高（r = 0.847），但由于 OD 测量的动态范围较小，其绝对相关性较低。
GVA 筛选抗生素对临床产气荚膜梭菌分离株的最低杀菌浓度
在成功利用 GVA 测定 CP1802 的 MBC 后，研究人员将其应用扩展到另外三种产气荚膜梭菌临床分离株（AN3、AN9 和 AN10），用四种抗生素进行测试。总共测量了 384 种活力条件，仅使用了 77mL 液体培养基和四个吸头盒。结果显示，不同菌株对不同抗生素的 MBC 值不同，耐药性解释也存在差异。所有菌株对庆大霉素耐药，除 CP1802 外，其他测试菌株对氨苄西林敏感，除 AN9 外，所有菌株对美罗培南表现为中度敏感。对于四环素，AN3 和 AN9 分离株表现为中度敏感，CP1802 耐药，AN10 敏感。AN3 菌株对氨苄西林最为敏感，MBC 和 MIC 值均 < 0.5mg/L。在新增的三种临床分离株中，庆大霉素的 MBC 值是 MIC 值的两倍；除 AN9 外，美罗培南的 MIC 和 MBC 值在所有测试菌株中相同，AN9 的 MBC 值比 MIC 值高 2 倍；与 CP1802 类似，AN3 和 AN9 菌株中四环素的 MIC 和 MBC 值也不相等，AN9 菌株的 MBC 值是 MIC 值的 8 倍。
厌氧 GVA 的优势、局限与应用前景
厌氧 GVA 在检测产气荚膜梭菌活力方面具有显著优势。与传统平板扩散法相比，它所需耗材更少，如进行 96 次活力测量，GVA 仅需一个 P200 移液器吸头盒、20mL 生长培养基（若需初始稀释则加 25mL）、一个储液器和一个 96 孔板，而传统稀释法需要 2400mL 生长培养基，且耗时 4 - 6 小时 。GVA 利用锥形吸头的几何形状原位进行稀释，避免了繁琐的稀释步骤，通过计算菌落与吸头尖端的距离来枚举 CFU，可在一个厌氧罐中准确高效地量化 96 个样本。此外，GVA 的动态范围更大，检测限比平板扩散法低 10 倍，这得益于其使用的较大培养体积（50μL） 。利用 GVA，研究人员能够量化产气荚膜梭菌对抗生素的剂量反应，表征不同的 MIC/MBC 模式，这在细菌耐药性日益增加、菌株敏感性难以预测的背景下具有重要意义。而且，GVA 有望检测出细菌对抗生素的异质性耐药 / 耐受亚群，例如四环素的 MIC 和 MBC 差异可能归因于样本中的异质性耐药。
在成像方面，研究人员开发了一种新的成像方法，使用 GelDoc/ChemiDoc 仪器。该仪器成像分辨率高，可在单个移液器吸头中实现 5 个数量级的动态范围，且在微生物学和分子生物学实验室中广泛可用，有助于提高 GVA 技术的可及性。
然而，厌氧 GVA 也存在一些局限性。在成像和菌落计数步骤，虽然有图像采集和菌落计数的流程，包括半自动菌落分割，但处理 96 个样本仍需约 30 分钟，是整个实验中最耗时的步骤。此外，菌落的三维结构使其形态评估具有挑战性，尤其是在高密度情况下，可能限制了在选择性培养基中通过形态识别细菌菌株的能力。本研究在常见的 2.5L 厌氧罐中进行实验，虽有更大体积的厌氧罐可增加培养吸头数量，但 GVA 在 AST 检测中的性能以及与其他厌氧 AST 方法的一致性，还需使用更广泛的临床分离株进一步研究。
总体而言，厌氧 GVA 大幅减少了厌氧菌活力检测所需的时间、材料和空间，与通用的厌氧菌培养罐兼容，可实现高通量活力筛选。该方法在人类、动物、环境和食品微生物学领域具有广阔的应用前景，有望推动相关领域的研究和发展。
