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来自美国的研究人员开展柯萨奇病毒 B3（CVB3）感染脑样内皮细胞研究，揭示其转录组差异，助力了解感染机制。
柯萨奇病毒 B3（Coxsackievirus B3，CVB3）是肠道病毒属的病原体，也是病毒性无菌性脑膜炎的主要病因之一。为引发脑膜炎，CVB3 必须通过与血脑屏障（blood - brain barrier，BBB）相互作用进入中枢神经系统（central nervous system，CNS）。血脑屏障由特殊的脑内皮细胞（brain endothelial cells，BECs）构成，能限制病原体进入脑实质，维持中枢神经系统的内环境稳定。虽然 CVB3 可感染 BECs，但人们对 BECs 对 CVB3 的反应了解甚少。
研究人员将诱导多能干细胞来源的脑样内皮细胞（induced pluripotent stem - cell - derived brain - like endothelial cells，iBECs）进行分化。从 pMKS1 质粒（Nancy H3 变体 pH3）和增强型绿色荧光蛋白（enhanced GFP，eGFP）序列构建出 eGFP - CVB3。eGFP 序列位于 5′非翻译区（5′ UTR）下游且在病毒多聚蛋白序列上游，二者之间有一个人工病毒蛋白水解切割位点，翻译后 eGFP 可从病毒多聚蛋白上自动切割下来。
用 eGFP - CVB3 或载体（10% 胎牛血清 [Corning；35010CV] 在杜氏改良伊格尔培养基 [Sigma - Aldrich；D6429] 中）以感染复数（multiplicity of infection，MOI）为 10 感染 iBECs，并在 37°C、5% CO2条件下培养 2 天或 5 天。通过观察病毒 eGFP 和检测感染后 5 天的空斑形成单位（PFU）增加情况，确认病毒复制。
使用 NucleoSpin RNA 试剂盒（Machery - Nagel；740955）从一次独立分化实验（n = 3）中分离 RNA。美国 Azenta 公司利用 Oligod (T) 磁珠进行 poly (A) 富集，并使用 NEBNext Ultra II RNA 文库制备试剂盒（用于 Illumina，美国马萨诸塞州伊普斯威奇的 New England Biolabs 公司）构建 cDNA 文库和进行 RNA 测序。利用 Illumina NovaSeq 6000 平台进行双端测序（2 × 150 碱基对），每个样本产生 2000 万条读数。用 FastQC 0.11.5 版本评估所得读数质量，用 TRIMGALORE 0.4.2 版本去除接头污染和质量分数低于 30 的核苷酸。使用 STAR 2.5.3a 版本和注释的人类基因组（GRCh38.110）进行读数映射，用 featureCounts（Subread 软件包）2.0.1 版本进行计数。通过 R 1.34.0 和 4.1.2 版本中的 DESeq2 进行差异基因表达分析，调整后的 P 值（Benjamini - Hochberg 方法）≤0.05 且 log2（倍数变化）＞2 的基因被视为差异表达基因。
数据显示，感染后 2 天和 5 天 iBECs 的转录本存在显著差异。感染后 2 天有 19 个转录本差异表达，感染后 5 天有 681 个转录本差异表达，其中 8 个转录本在两组中均存在，且这些转录本参与调节抗病毒反应。利用干细胞来源的 BECs 研究 CVB3 感染，相比其他不允许 CVB3 感染的体外血脑屏障模型具有优势。
感谢美国加利福尼亚州圣地亚哥州立大学的 Ralph Feuer 博士提供本研究使用的 HeLa RW 细胞株和 pMKS1 质粒。D.W.L. 感谢阿拉巴马大学在 UAHPC 上提供的计算时间。图片由
BioRender.com制作。
本研究部分由美国国立卫生研究院（NIH）/ 国家神经疾病和中风研究所（NINDS）R15NS131921（B.J.K.）和 NIH / 国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所（NIDDK）R01DK125692（J.S.）资助。B.J.K. 和 J.S. 构思了本研究。N.V.、S.F.H. 和 T.E.K. 进行实验。S.F.H.、T.E.K. 和 N.V. 撰写并编辑手稿。S.F.H. 分析数据并生成图表。D.W.L.、N.V. 和 S.F.H. 分析和解读转录组数据集。J.S.、B.J.K. 和 N.V. 为实验提供咨询。所有作者阅读并批准了最终手稿。
