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这篇研究聚焦于牙龈内阿米巴（Entamoeba gingivalis）感染与牙周炎的关联。研究发现，VAMP8 和 VAMP3 在牙龈防御及病原体感染机制中起关键作用。这一成果为牙周炎防治提供了新方向，值得相关领域科研人员阅读。
### 研究背景
牙周炎被认为是由多微生物感染和遗传易感性共同导致的疾病，其特征为黏膜反复炎症、牙龈出血和组织损伤。牙龈内阿米巴（
Entamoeba gingivalis）是一种常见于牙周炎患者炎症牙周袋中的原生动物，它能侵入口腔黏膜并杀死细胞，还可诱导促炎细胞因子的激活。在全基因组关联研究中，发现囊泡相关膜蛋白基因（
VAMP3）和（
VAMP8）的遗传变异与牙周炎相关。在肠道中，这些基因在宿主防御和免疫逃避方面有重要作用，如 VAMP8 调节粘蛋白分泌形成黏液屏障，VAMP3 调节基质金属蛋白酶（MMPs）分泌影响细胞外基质（ECM）降解。由于牙周炎与肠道阿米巴病症状相似，且（
VAMP3）和（
VAMP8）在宿主与病原体相互作用中起关键作用，本研究旨在探究这两个基因在牙龈内阿米巴与人类牙龈上皮细胞（gECs）和牙龈成纤维细胞（gFBs）相互作用中的作用。
实验方法
- 构建基因敲除细胞系：利用 CRISPR-Cas9 系统，在永生化的牙龈上皮细胞系（OKG4）中敲除（VAMP8），在永生化的人牙龈成纤维细胞系（ihGF-hTERT）中敲除（VAMP3），获得 gEC-VAMP8 (-/-) 和 gFB-VAMP3 (-/-) 细胞系。
- 病原体获取与培养：从牙周炎患者的炎症牙周袋中采集龈下菌斑样本，分离培养牙龈内阿米巴。使用哥伦比亚血琼脂平板培养牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）。
- 细胞培养：gFBs 和 gFB-VAMP3 (-/-) 在添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 非必需氨基酸（MEM-NEAA）的杜氏改良 Eagle 培养基（DMEM）中培养；gECs 和 gEC-VAMP8 (-/-) 在 DermaLife K 完全培养基中培养。
- 实验检测方法：运用免疫荧光检测蛋白共定位；采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测 IL-8、MUC1 和 MUC21 水平；使用免疫分析法定量检测 IL-1β；通过脂质筏分离、免疫印迹、细胞毒性和胶原酶活性测定等实验进行相关指标分析。
实验结果
- 成功构建基因敲除细胞系：经 Sanger 测序分析，在 gECs 的（VAMP8）基因和 gFBs 的（VAMP3）基因中均成功引入功能丧失性突变。
- 蛋白共定位：在 gECs 中，VAMP8 与 MUC1、MUC21 共定位；在 gFBs 中，VAMP3 与 MMP13 共定位。
- 粘蛋白分泌：牙龈内阿米巴感染野生型 gECs 后，MUC1 和 MUC21 分泌显著增加；但在 gEC-VAMP8 (-/-) 细胞中，无论是否感染，粘蛋白分泌均无法检测到，表明 VAMP8 介导 gECs 的粘蛋白分泌。
- 细胞因子分泌：牙龈内阿米巴感染野生型 gECs 可显著增加 IL-8 和 IL-1β 分泌，而在 gEC-VAMP8 (-/-) 细胞中检测不到；VAMP8 参与 gECs 中 IL-8 和 IL-1β 的分泌，VAMP3 不参与。
- VAMP8 的转位：牙龈内阿米巴感染 gECs 后，VAMP8 向细胞膜脂质筏区域转位增加；在 gEC-VAMP8 (-/-) 细胞中未观察到这种转位，证实 VAMP8 参与感染后的胞吐过程。
- 细胞死亡：牙龈内阿米巴感染导致 gEC-VAMP8 (-/-) 细胞死亡显著增加，而对 gFBs 细胞死亡影响不明显；牙龈卟啉单胞菌感染对 gECs 和 gFBs 细胞死亡影响较小。
- 胶原酶激活：牙龈内阿米巴感染可诱导野生型 gFBs 的胶原酶激活，但在 gFB-VAMP3 (-/-) 细胞中未观察到，表明 VAMP3 对牙龈成纤维细胞中 MMP 分泌和胶原降解至关重要。
研究结论
本研究表明，牙龈内阿米巴感染牙龈细胞的机制与肠道内阿米巴感染相似，VAMP8 和 VAMP3 在牙龈黏膜防御和牙龈内阿米巴致病过程中起核心作用。VAMP8 功能受损会削弱牙龈屏障保护，VAMP3 介导的 MMP 分泌参与组织破坏。然而，本研究存在局限性，如体外实验、仅分析早期感染阶段等。总体而言，VAMP8 和 VAMP3 可能是牙周炎相关感染治疗的潜在靶点，牙龈内阿米巴是导致慢性炎症和组织破坏的重要口腔病原体。
