Engineering mouse chymotrypsin B1 for improved trypsinogen degradation：改造小鼠糜蛋白酶 B1，增强胰蛋白酶原降解能力

为探究提升小鼠 CTRB1 活性的方法，研究人员对其进行突变研究，发现突变影响具底物特异性，对构建小鼠胰腺炎模型意义重大。

　　

改造小鼠糜蛋白酶 B1，增强胰蛋白酶原降解能力研究解读

在人体的消化系统中，胰腺就像一个精密且至关重要的 “加工厂”，它所分泌的各种消化酶协同工作，帮助人体高效地消化食物。然而，当这个 “加工厂” 内部的酶平衡被打破时，就可能引发各种健康问题，其中慢性胰腺炎就是一种令人困扰的疾病。

慢性胰腺炎的发病机制较为复杂，而胰蛋白酶原异常激活在其中扮演了关键角色。正常情况下，胰腺会分泌一种名为丝氨酸蛋白酶抑制剂（SPINK1）的物质，它如同 “忠诚卫士” 一般，时刻守护着胰腺，防止胰蛋白酶原提前激活。但当 SPINK1 的防御能力耗尽，胰蛋白酶原就可能被异常激活，转化为有活性的胰蛋白酶。过多的胰蛋白酶会对胰腺组织发起 “攻击”，导致胰腺自身消化，进而引发胰腺炎。

这时，糜蛋白酶（CTR）登场了，它肩负着保护胰腺的重任。CTR 能够通过促进胰蛋白酶原的降解，来减少胰腺内胰蛋白酶的活性，从而在一定程度上缓解胰腺炎的发生和发展。在人体中，主要存在 CTRB1、CTRB2、CTRC 和 CTRl 等多种糜蛋白酶同工型，它们在保护胰腺的过程中各自发挥着不同作用。而在常用的实验室小鼠如 C57BL/6J 和 C57BL/6N 中，由于基因的单核苷酸缺失，自然缺乏 CTRC，此时 CTRB1 就成为了保护胰腺免受胰腺炎侵害的 “主力军”，它主要通过裂解小鼠阴离子（T8 和 T9）和阳离子（T7）胰蛋白酶原来发挥作用 。

此前研究发现，人 CTRB2 中的 Arg²³⁶是其具有较高蛋白水解活性和更好胰蛋白酶原降解能力的关键，将 Arg²³⁶引入人 CTRB1 中，能显著提高对人阴离子胰蛋白酶原的降解。基于此，来自美国加利福尼亚大学洛杉矶分校、匈牙利德布勒森大学等机构的研究人员，想要探究能否通过改变小鼠 CTRB1 中 Gly²³⁶为 Arg（构建 G236R 突变体）和 / 或拓宽底物结合口袋（构建 A244G 突变体），来提高小鼠 CTRB1 的活性，相关研究成果发表在《Scientific Reports》上。

研究人员在此次研究中运用了多种关键技术方法。在蛋白表达与纯化方面，将小鼠胰蛋白酶原在大肠杆菌中表达，利用 ecotin 亲和层析法进行纯化；野生型和突变型小鼠 CTRB1 在 HEK 293T 细胞中通过瞬时转染表达，经镍亲和层析从条件培养基中纯化。采用活性位点滴定法，以 ecotin 滴定确定活性小鼠 CTRB1 及其突变体的浓度。运用酶动力学分析，在特定缓冲液条件下，测定不同底物水解速率，通过拟合米氏方程获取 K_M和 k_cat值。利用 SDS-PAGE 和考马斯亮蓝染色结合密度测定法，分析酪蛋白和胰蛋白酶原的消化情况。还借助进化保守性分析和结构建模，评估序列保守性并预测酶 - 底物复合物结构。

研究结果如下：

• 突变对酶活性影响：构建单突变体 G236R、A244G 和双突变体 G236R-A244G，用发色肽底物检测。结果显示，G236R 催化效率略有提高（依赖肽 N 端带负电的琥珀酰基），A244G 降低催化效率且使酶对部分肽无活性，双突变体 G236R-A244G 催化效率也降低，说明这些突变对小鼠 CTRB1 在小肽底物上的活性影响较小且各有差异。
• 对酪蛋白消化作用：用突变体消化牛 β- 酪蛋白，SDS-PAGE 和密度测定分析。发现 G236R 对酪蛋白降解无影响，A244G 和 G236R-A244G 分别使消化速率降低 1.4 倍和 3.3 倍，与肽底物实验中 A244G 对催化活性的负面影响一致，且 G236R 无法像人 CTRB1 的 D236R 突变那样促进小鼠 CTRB1 对酪蛋白的消化。
• 对胰蛋白酶原消化效果：用突变体消化小鼠阴离子（T8）和阳离子（T7）胰蛋白酶原。G236R 使小鼠 CTRB1 对 T8 胰蛋白酶原的消化效率提高 32 倍，A244G 使其降低 2.4 倍，双突变体 G236R-A244G 消化速度介于两者之间；而对于 T7 胰蛋白酶原，G236R 无促进作用，A244G 降低消化速率，双突变体效果类似 A244G，表明 G236R 的刺激作用具有底物依赖性。
• Asp¹⁵⁶的作用：通过结构建模推测小鼠阴离子（T8）胰蛋白酶原中的 Asp¹⁵⁶可能与 G236R 小鼠 CTRB1 突变体的 Arg²³⁶相互作用影响裂解效率。构建 D156S 突变体验证，结果显示 G236R 对 D156S 突变体的消化速度仅比野生型快 4.9 倍，远低于对野生型 T8 胰蛋白酶原的 32 倍，证实 Asp¹⁵⁶是 G236R-CTRB1 突变体裂解效率的重要决定因素。
• 人源酶对小鼠胰蛋白酶原的作用：用人类 CTRB1、CTRB2 和 CTRB1 D236R 突变体消化小鼠胰蛋白酶原。发现人 CTRB1 几乎不消化小鼠胰蛋白酶原，而 CTRB2 和 CTRB1 D236R 突变体能快速裂解，且 CTRB2 对阳离子（T7）胰蛋白酶原的消化能力比 CTRB1 D236R 突变体强近三倍，表明 Arg²³⁶的刺激作用受环境和底物影响。

研究结论与讨论部分指出，此次研究中突变对小鼠 CTRB1 的影响与之前人 CTRB1 D236R 突变的结果不同。结构建模显示，人 CTRB1 中 Asp²³⁶会部分阻碍底物结合凹槽，D236R 突变可解除这种阻碍，但小鼠 CTRB1 中 Gly²³⁶不存在此问题，所以 G236R 突变不能完全重现人 CTRB1 D236R 突变的效果。小鼠 CTRB1 的 G236R 突变对阴离子（T8）胰蛋白酶原消化的促进作用，可能与 T8 胰蛋白酶原的 Phe¹⁵⁰裂解位点及 Asp¹⁵⁶有关。

这项研究成果为设计具有更高胰蛋白酶原降解能力和更强抗胰腺炎能力的临床前小鼠模型提供了重要依据。增强胰腺内保护性糜蛋白酶的活性有望成为治疗慢性胰腺炎的新策略，而小鼠模型可以为这一策略提供概念验证。在未来临床应用中，或许可通过腺相关病毒（AAV）载体将基于糜蛋白酶的疗法输送到胰腺，为慢性胰腺炎的治疗开辟新方向。