揭秘家蚕抗病毒 “卫士” circRNA_1193：从发现到机制解析

本文聚焦家蚕，发现一种新型环状 RNA（circRNA_1193），源自膜丙氨酰氨肽酶样（mAAP）基因。研究表明，circRNA_1193 在抗家蚕质型多角体病毒（BmCPV）感染中发挥关键作用，为深入理解环状 RNA 抗病毒机制及开发新疗法提供重要依据。

　　

引言

环状 RNA（circRNAs）是一类特殊的非编码 RNA，具有共价闭合结构，无 5′ 帽和 3′ polyA 尾 。其独特结构赋予了多种生物学功能，如作为微小 RNA（miRNAs）的分子海绵、调节转录，甚至具备潜在的编码能力。在病毒感染过程中，circRNAs 参与多种影响病毒复制的途径，如通过海绵作用调控宿主因子表达，或与病毒蛋白相互作用影响病毒致病机制和宿主免疫反应。

在家蚕研究领域，家蚕不仅用于养蚕业，还是研究昆虫生理和病理的模式生物。深入了解家蚕 circRNAs 与病毒，尤其是家蚕质型多角体病毒（BmCPV）之间的相互作用，有助于揭示家蚕的先天免疫反应机制，为提高家蚕抗病能力提供新的思路。此前研究发现，BmCPV 感染会导致家蚕中肠大量 circRNAs 表达失调，且多数与代谢和先天免疫相关。其中，circEgg 可通过海绵作用调控组蛋白修饰并编码蛋白。而 circRNA_1193，预测源自家蚕膜丙氨酰氨肽酶样（mAAP）基因的 5 - 9 外显子，mAAP 基因对 BmCPV 感染有响应，但 circRNA_1193 影响病毒复制的机制及功能意义尚不明晰。本研究旨在探究 circRNA_1193 在 BmCPV 感染中的调控作用。

结果

1. 家蚕 circRNAs 在 BmCPV 感染期间的动态变化：从先前高通量测序数据中选取 20 种因 BmCPV 感染而高表达的 circRNAs，分析其在 BmCPV 感染 BmN 细胞后 24、48、72 和 96 小时的表达模式。经 RNase R 处理去除线性 RNA 后，利用发散引物进行逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）扩增。结果显示，这些 circRNAs 的表达水平在不同时间点波动显著。感染初期（24 小时）为基线表达，48 - 72 小时许多 circRNAs 出现明显上调或下调，96 小时表达模式继续变化，其中 circRNA_1193 在感染后高诱导表达。这表明 circRNAs 在宿主应对病毒感染的免疫反应和代谢调节中发挥重要作用。
2. BmCPV 感染细胞中家蚕 circRNA_1193 的实验验证：生物信息学分析表明 circRNA_1193（933 nt）源自家蚕 mAAP 基因的 5 - 9 外显子。为验证其存在，采用多种分子生物学技术。用 RNase R 处理 RNA 样本后，分别使用发散引物和收敛引物进行 RT-PCR，Sanger 测序确认扩增产物。通过对 cDNA 和基因组 DNA（gDNA）进行 PCR 扩增并测序，证实 circRNA_1193 的环状结构及基因组来源。此外，Northern blotting 在 BmCPV 感染的家蚕细胞中检测到对应条带，原位杂交显示其在 BmN 细胞细胞质中有明显信号，进一步确认 circRNA_1193 的存在与表达。
3. circRNA_1193 在 BmCPV 感染时表达显著升高：检测 circRNA_1193 在家蚕不同组织中的表达，发现其在中肠和马氏管中高表达，暗示其与 BmCPV 感染时的代谢和免疫途径相关。在 BmCPV 感染 BmN 细胞的过程中，circRNA_1193 的相对表达量随时间逐渐增加，120 小时达到最高。分别用 BmCPV、家蚕核型多角体病毒（BmNPV）和脂多糖（LPS）处理 BmN 细胞，只有 BmCPV 处理导致 circRNA_1193 水平明显上升，表明其对 BmCPV 感染具有特异性响应，可能在家蚕抵御 BmCPV 感染中发挥特殊作用。
4. circRNA_1193 在病毒感染中的功能：构建瞬时表达载体 pIZT-LcR-circRNA_1193 在家蚕细胞中过表达 circRNA_1193，通过实时 PCR 和蛋白质免疫印迹（Western blotting）检测发现，BmCPV 的病毒基因和蛋白表达水平显著降低，表明 circRNA_1193 可能具有抗病毒活性。利用靶向 circRNA_1193 连接位点的小干扰 RNA（siRNAs）进行敲低实验，实时 PCR 和 Western blotting 结果显示，敲低 circRNA_1193 后，病毒基因和蛋白（VP4）表达水平显著增加，进一步证实 circRNA_1193 在抗 BmCPV 感染中的重要作用。
5. circRNA_1193 并非通过调节其亲本基因（mAAP）抑制 BmCPV 感染：转染 mAAP 特异性 siRNA 和 pIZT-LcR-circRNA_1193 后感染 BmCPV，48 小时后提取总蛋白和 RNA 进行 Western blotting 和实时 PCR 分析。与非靶向 siRNA 对照相比，BmCPV S1 转录水平和 VP7 蛋白表达无显著变化，说明 circRNA_1193 抑制 BmCPV 感染的作用并非通过调节其亲本基因 mAAP 实现。
6. 异位表达 circRNA_1193 翻译的蛋白质：生物信息学分析显示 circRNA_1193 存在潜在的滚环开放阅读框（ORF）、m⁶A 甲基化位点和内部核糖体进入位点（IRESs）元件，暗示其可能发生非经典翻译。选取最大 ORF（933 nt/311 aa），构建 pIZT-LcR-circRNA_1193-DsRed 质粒，将预测的 ORF 替换为 DsRed 基因。Western blotting 检测到对应大小的蛋白条带，转染后在倒置荧光显微镜下观察到红色荧光，证实 circRNA_1193 可翻译蛋白。此外，预测的 IRES 样序列（GGCAAATGATG）能显著增强 Luc 报告基因活性。
7. circRNA_1193 依赖的病毒抗性由其编码的蛋白质介导：构建包含 circRNA_1193 ORF 序列且 C 端融合血凝素（HA）标签的重组表达质粒 pIZT-V5/His-ORF-HA，转染 BmN 细胞后通过 Western blotting 检测到 HA 信号带，证实 ORF-HA 融合蛋白成功表达。用不同剂量（1 μg、2 μg 或 3 μg）的 pIZT-V5/His-ORF-HA 质粒或空载体对照转染 BmN 细胞，感染 BmCPV 后检测发现，ORF 表达以剂量依赖方式显著抑制 BmCPV 复制，表明 circRNA_1193 编码的蛋白质在介导抗 BmCPV 防御中起关键作用。
8. circRNA_1193 介导的抑制 BmCPV 增殖涉及蛋白质：构建突变表达载体 pIZT-LcR-circRNA_1193mut，将起始密码子（ATG）突变为终止密码子（TAA），阻止 circRNA_1193 ORF 翻译。将野生型（pIZT-LcR-circRNA_1193）和突变型质粒分别转染 BmN 细胞后感染 BmCPV，结果显示，野生型质粒转染细胞的病毒复制显著降低，而突变型质粒转染细胞的病毒复制水平显著增加，实时 PCR 和 Western blotting 结果进一步证实 circRNA_1193 的抗病毒活性依赖其编码的蛋白质。
9. 侧翼短重复序列足以产生 circRNA_1193：序列分析发现 mAAP 基因外显子 2 和 9 侧翼的 240 bp 区域含有两个高度重复序列，推测其可能参与 circRNA_1193 的环化过程。构建一系列包含不同侧翼短重复序列的质粒，体外转录 RNA 片段后转染 BmN、草鱼肾细胞（CIK）和小鼠成纤维细胞（L929）。电泳和 Sanger 测序结果显示，只有包含两侧天然侧翼短重复序列的 RNA 片段在 BmN 细胞中形成可检测的 circRNA 连接位点，表明特定序列元件对 circRNA 生物发生至关重要，且该过程存在细胞类型特异性。构建不同侧翼序列长度的质粒转染 BmN 细胞，实时 PCR 检测发现 70 - 80 bp 的短重复序列在 circRNA_1193 环化过程中起关键作用。

讨论

本研究揭示了 circRNA_1193 在 BmCPV 感染中的重要作用，证实其为一种新型蛋白质编码环状 RNA，具有抗病毒功能。circRNA_1193 在家蚕组织中表达，并在病毒感染时发生调节，参与家蚕抗 BmCPV 防御机制。circRNAs 因其独特结构具有多种功能，可调节基因表达和影响病毒感染。本研究中，circRNA_1193 过表达抑制 BmCPV 复制，敲低则促进病毒复制，表明其是病毒复制的重要负调节因子。

circRNAs 的编码潜力是当前研究热点，本研究发现 circRNA_1193 起始密码子突变后，其抑制病毒复制的作用消失，强调了翻译蛋白在抗病毒反应中的必要性，说明 circRNA_1193 可能像传统抗病毒蛋白一样发挥作用。circRNA_1193 与 miRNAs 的相互作用也值得关注，它可能通过海绵作用间接增加抗病毒相关靶基因的表达，调控基因表达网络，精细调节宿主对病毒感染的反应。此外，circRNA_1193 还可调节宿主免疫反应，如调节 miR-277-5p/zinc finger 729 轴抑制病毒复制，后续研究该轴有助于深入了解宿主抗 BmCPV 防御机制。

研究还发现 circRNA_1193 的形成与反向互补侧翼序列密切相关，70 - 80 bp 的短重复序列在其形成中起关键作用。侧翼序列的变化会影响 circRNA 生物发生，这表明前体 mRNA 的结构和序列互补性等多种因素可调节 circRNA 的形成。深入了解这些机制有助于开发基于 circRNA 的治疗策略，用于对抗病毒感染。

综上，circRNAs 在抗病毒策略中具有重要潜力，本研究对 circRNA_1193 的研究为揭示 circRNAs 与病毒病原体之间的复杂相互作用提供了新视角，进一步探索病毒 - 宿主相互作用中的 circRNA 动态变化，有望为提高家蚕及其他物种的抗病毒能力提供新策略。