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为探究骨关节炎（OA）中 PANoptosis 相关基因的作用及寻找治疗药物，研究人员通过生物信息学和单细胞分析开展研究。结果发现 OA 中多个 PANoptosis 相关基因差异表达，穿心莲内酯（AG）有治疗潜力，为 OA 治疗提供新思路。
骨关节炎（Osteoarthritis，OA）是一种常见的退行性关节疾病，就像关节的 “老化危机”。它主要表现为关节软骨的逐渐破坏、骨赘形成以及关节腔内炎症。随着年龄增长，很多人都深受其扰，不仅关节疼痛、活动受限，生活质量也大幅下降，还给社会和家庭带来沉重的经济负担。尽管科研人员一直在努力探索 OA 的发病机制，但目前仍未完全明晰。以往研究发现细胞凋亡（Apoptosis）在 OA 发展中起重要作用，可现有研究大多聚焦单个凋亡基因，对于 PANoptosis（一种炎症性程序性细胞死亡，整合了细胞焦亡 Pyroptosis、凋亡和坏死性凋亡 Necroptosis 的关键特征）相关基因在 OA 中的作用，却知之甚少。而且，寻找有效的 OA 治疗药物也是临床研究的一大难题。
为了解开这些谜团，西南医科大学附属中医医院骨科的研究人员开展了一项研究，相关成果发表在《Biology Direct》上。该研究旨在探索 PANoptosis 在 OA 中的作用机制，并评估穿心莲内酯（Andrographolide，AG）作为 OA 治疗药物的潜力。
研究人员采用了多种关键技术方法。首先，从公共数据库获取基因表达数据集，利用 Limma 方法筛选差异表达基因（Differentially Expressed Genes，DEGs）。接着，运用加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co-Expression Network Analysis，WGCNA）构建基因共表达网络，挖掘关键模块基因。通过整合多个数据库资源，确定 PANoptosis 相关基因和 OA 疾病相关基因，并构建蛋白质 - 蛋白质相互作用（Protein - Protein Interaction，PPI）网络筛选关键基因。此外，利用单细胞 RNA 测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）技术，从单细胞层面深入分析 OA 软骨细胞的基因表达特征，识别关键细胞亚群 。还通过分子对接、Western blotting、qRT-PCR 等实验，在细胞和动物水平验证 AG 对关键基因的调控作用。
下面来看看具体的研究结果：
- 差异表达基因的鉴定：研究人员通过 Limma 快速差异分析方法，鉴定出 2291 个 DEGs，其中 918 个基因表达下调，1373 个基因表达上调。这些差异表达基因是后续研究的重要基础，它们就像 OA 发病过程中的 “信号灯”，指示着疾病发生发展的关键环节。
- WGCNA 和关键模块的识别：在 WGCNA 分析中，确定了合适的参数，筛选出与 OA 相关性最强的绿松石模块，该模块包含 103 个核心基因。这一模块的发现，为进一步探究 OA 的发病机制提供了关键线索，表明这些核心基因可能在 OA 进程中发挥着重要作用。
- PANoptosis 关键基因的筛选和 GSEA 通路分析：通过整合多种基因数据集构建 PPI 网络，研究人员识别出 12 个 PANoptosis 关键基因，其中 4 个最为显著。基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）显示，这些关键基因显著富集在与凋亡、细胞焦亡、坏死性凋亡等相关的信号通路中。这意味着这些细胞死亡过程在 OA 的发病机制中可能起着至关重要的作用。
- 免疫浸润结果分析：利用 CIBERSORT 算法评估 PANoptosis 关键基因的免疫浸润情况，发现浆细胞、T 细胞、肥大细胞、巨噬细胞（M0、M1 和 M2）和 B 细胞等免疫细胞与这些基因密切相关。而且，浆细胞、T 细胞和巨噬细胞在不同亚组间存在显著差异，提示免疫细胞的异常浸润可能参与了 OA 的炎症反应和疾病进展。
- 富集分析：对 12 个关键基因进行功能富集分析，KEGG 通路分析表明它们参与 85 条信号通路，在凋亡、坏死性凋亡、Toll 样受体（Toll-like receptor，TLR）信号通路等多个重要通路中显著富集；GO 富集分析发现这些基因在 346 个 GO 术语中富集，涉及多种生物过程、细胞组分和分子功能。这些结果进一步揭示了关键基因在 OA 中的生物学功能和作用机制。
- 单细胞数据的批次效应校正和细胞亚群定义：对单细胞数据进行批次效应校正后，研究人员将细胞分为 7 个不同的亚群，分别是上皮细胞（Epithelial Cells，EC）、前肥大软骨细胞（Pre-hypertrophic Chondrocytes，preHTC）、静息软骨细胞（Resting Chondrocytes，RepC）、稳态软骨细胞（Homeostatic Chondrocytes，HomC）、增殖软骨细胞（Proliferative Chondrocytes，ProC）、纤维软骨细胞（Fibrocartilage Cells，FC）和红细胞（Red Blood Cells，RBC）。明确这些细胞亚群，有助于深入了解 OA 中不同细胞类型的特征和功能。
- 单细胞轨迹分析和细胞亚群特征：运用 Monocle2 进行细胞轨迹分析发现，preHTC 细胞位于分化的关键节点，可能在 OA 中发挥重要作用。细胞亚群丰度分析显示，OA 组中 preHTC、FC、EC、ProC 和 RepC 细胞比例增加，而 HomC 细胞比例显著降低，这反映了 OA 病理过程中细胞组成的重塑。差异表达分析表明，OA 软骨细胞中 PANoptosis 关键基因表达显著增加，且这些基因在不同细胞亚群中的表达具有特异性，如 CASP8 和 CASP1 在 preHTC 细胞中高表达，TLR3 表达较为分散，IL18 在多种细胞亚群中高表达。这些结果揭示了不同细胞类型在 OA 病理中的潜在作用和关键 PANoptosis 基因的表达特征。
- 分子对接结果：对 4 个 PANoptosis 关键基因（CASP8、CASP1、TLR3、IL18）与 AG 进行分子对接，结果显示 AG 与这些关键基因的结合能均低于 - 5 kJ/mol，表明 AG 与它们具有良好的结合亲和力，为 AG 作为 OA 治疗药物提供了理论依据。
- 穿心莲内酯对 PANoptosis 关键基因的治疗作用：体外实验中，研究人员用不同浓度的 IL - 1β 处理软骨细胞，确定 10 ng/ml 为最佳干预浓度。Western blot 和 qRT-PCR 结果显示，AG 处理可显著降低模型组中 4 个 PANoptosis 关键基因的表达水平，表明 AG 能有效改善软骨细胞中的 PANoptosis，具有治疗 OA 的潜力。
- 体内验证结果：在大鼠 OA 模型中进行体内实验，HE 染色和 Safranin O/fast green 染色结果显示，AG 治疗组的软骨结构相对完整，表面更光滑，细胞排列更有序，软骨厚度部分恢复，软骨基质降解减轻。这进一步证实了 AG 在体内具有治疗 OA 的效果，能促进软骨修复，减缓 OA 进展。
研究结论和讨论部分指出，本研究强调了 PANoptosis 在 OA 发病机制中的关键作用，识别出的 CASP8、CASP1、TLR3 和 IL18 等关键基因可作为潜在的治疗靶点。AG 作为一种潜在的多靶点治疗药物，能有效调节 PANoptosis 关键基因的表达，改善软骨细胞的病理状态，且与传统 OA 治疗药物相比，具有多靶点作用、安全性好等优势。虽然 AG 存在生物利用度低的问题，但通过纳米制剂、前药策略等手段有望解决。该研究为 OA 的治疗提供了新的思路和潜在的治疗方案，对推动 OA 治疗领域的发展具有重要意义。
