解析真菌绒毡层结构：构巢曲霉 VelB 的关键作用

这篇研究聚焦真菌绒毡层转录因子，通过对 4999 个真菌绒毡蛋白的绒毡结构域对比，揭示其保守架构。以构巢曲霉（Aspergillus nidulans）VelB 为范例，确定关键氨基酸残基，还发现 VelB 二聚化连接子对长度缩短有一定耐受性，为真菌调控机制研究提供重要依据。

　　

引言

真菌在人类生活中扮演着重要且复杂的角色。一方面，它们在食品和药物生产中不可或缺；另一方面，又可能成为致病菌，危害人类、植物和动物的健康。次生代谢产物（SMs）与真菌的这两种特性密切相关，并且其产生与真菌的有性和无性繁殖等发育过程紧密相连。

绒毡蛋白是调控这些过程的关键因子，它在真菌中普遍存在，似乎仅存在于后鞭毛生物（Opisthokonta）中。在构巢曲霉中，已发现 4 种绒毡蛋白编码基因，分别为 velvet A（veA）、velvet - like B（velB）、velvet - like C（velC）和 viability of spores A（vosA）。veA 缺失会导致闭囊壳产生丧失和次生代谢改变；velB 缺失也有类似表型；velC 在发育过程中作用相对较小，其缺失会使有性子实体形成略有减少，分生孢子数量增加；vosA 对孢子活力至关重要，还能抑制无性发育。

绒毡蛋白可形成同源二聚体和多种异源二聚体，如 VeA - VelB 异源二聚体在黑暗中进入细胞核，激活有性发育所需基因；VelB - VosA 二聚体在细胞核中形成，抑制无性发育并维持孢子活力。此外，在黑暗中还能形成由 VelB、VeA 和甲基转移酶 LaeA 组成的异源三聚体，协调发育与次生代谢。然而，绒毡蛋白相互作用的完整分子机制仍未完全明晰。

研究对 4999 个真菌绒毡结构域进行比较，发现其具有共同架构，包括 N 端 DNA 结合区域、可变区域和 C 端二聚化区域，后者又包含由连接子分隔的两个亚基。同时，鉴定出两个对 VelB 二聚化至关重要的保守氨基酸残基，它们是同源或异源二聚体形成的前提条件。

结果

1. 绒毡结构域由 DNA 结合区域、可变区域和二聚化区域构成：通过对 VosA 晶体分析和功能研究发现，绒毡结构域折叠成高度扭曲的 β - 三明治结构，N 端部分参与 DNA 结合。对 4999 个预测的真菌绒毡结构域进行计算机分析，结果表明，约 30 个氨基酸长度的 N 端 DNA 结合区域和约 100 个氨基酸长度的 C 端绒毡二聚化区域是保守的，它们由可变区域连接。

可变连接区域在序列和长度上均不保守，甚至可能缺失，其长度范围从 0 个氨基酸到超过 400 个氨基酸不等，47% 的分析绒毡蛋白的可变区域长度在 40 - 60 个氨基酸之间，担子菌通常具有较大的可变区域，而其他真菌类群则较少见。C 端二聚化区域包含两个保守部分（α - 和 β - 亚基），由连接子区域连接，连接子长度也可变，63% 的分析序列中连接子长度在 15 - 25 个氨基酸之间。

1. VelB 二聚化区域的甘氨酸 240 和亮氨酸 331 对准确发育和次生代谢至关重要：比较 4999 个绒毡结构域的二聚化区域，确定了 30 个保守氨基酸（阈值：比特值超过 2）。在构巢曲霉的 4 种绒毡蛋白中，VelB 氨基酸数量最少且在真菌界中保守性最高，因此被选作分析二聚化区域的范例。

采用丙氨酸扫描技术，将 VelB 开放阅读框中 α - 和 β - 亚基的 30 个保守氨基酸对应的密码子逐个替换为小丙氨酸残基的密码子。结果发现，一些突变菌株的生长表型与野生型存在差异。氨基酸交换主要影响无性发育过程中的菌落颜色，表明对次生代谢有影响。例如，velB^G240A突变体在无性条件下的菌落颜色与 velB 缺失菌株相似；在黑暗促进有性发育的条件下，G240A 氨基酸交换的菌株表现出最明显的表型，无法产生有性子实体，类似 velB 缺失菌株。L331A 突变体在中间表型菌株中较为突出，导致有性发育受阻，几乎不产生有性子实体。

对野生型和 velB 突变菌株的 12 种 SMs 进行比较分析，发现 velB 变异体的次生代谢发生改变，其代谢物谱与 velB 缺失菌株部分重叠。与野生型相比，velB 变异体和缺失菌株中一些代谢物的产量减少或不产生，如 Emericellin、Epishamixanthone、F9775A/B 和 Shamixanthone；而另一些代谢物如 Asperthecin、Cichorine、Emericellamide C、Emericellamide E 和 Terrequinone A 的产量则增加。值得注意的是，与野生型相比，?velB、velB^G240A和 velB^{G240A, L331A}突变体检测不到 Sterigmatocystin 的产生，而 velB^L331A突变体中 Sterigmatocystin 的产量增加，Austinoneol A 在野生型和 velB 突变菌株中的产量较为稳定。这些结果表明，亮氨酸 331（L331）和甘氨酸 240（G240）在 VelB 调节真菌发育和次生代谢的功能中起着重要作用。

1. VelB 二聚化区域的 G240 和 L331 对同源二聚化以及与 VeA 的异源二聚体形成至关重要：VelB 中 G240A 和 L331A 的氨基酸替换导致次生代谢改变和有性发育减少。通过酵母双杂交实验研究这些替换是否影响 VelB 与其他绒毡结构域调节因子的相互作用。将野生型 VelB 蛋白与 VelB 变异体 G240A、L331A 以及双替换 G240A 和 L331A 的相互作用进行比较，测试了 VosA 和 VeA 的缩短版本以及全长 VelB 蛋白，以聚焦绒毡结构域作为细胞相互作用伙伴形成异源二聚体或同源二聚体的情况。

Western blot 实验监测不同构巢曲霉 VelB 变异体在酿酒酵母中的表达，结果显示所有构建体均检测到正确大小的蛋白质。酵母双杂交实验结果表明，VelB 的单个变异体（L331A 和 G240A）以及双氨基酸替换变异体在与 VeA 和自身的相互作用中均受损，表现为在选择平板上生长受抑制。与 VosA 的相互作用在表达 VelB^G240A的细胞中完全被抑制，而在表达 VelB^L331A的细胞中仅部分被抑制。VosA - VelB 复合物的晶体结构显示，G240 残基通过形成氢键直接与 VosA 相互作用，进一步支持了 G240 在与 VosA 相互作用中的重要性。综上所述，G240 和 L331 有助于与绒毡蛋白的相互作用，G240 在与所有三种测试的绒毡蛋白的相互作用中都起着重要作用，而 L331 主要参与与 VeA 和 VelB 的相互作用，对与 VosA 的相互作用影响较小，它们被丙氨酸替换会破坏其在二聚化中的功能。

1. VeA 和 VosA 中的 G240 和 L331 对应残基对绒毡蛋白的完整功能至关重要：VelB 二聚化区域中的 G240 和 L331 对与 VeA 和 VelB 的相互作用是必需的，G240 对与 VosA 的相互作用也很重要，L331 在一定程度上也参与其中。对 VelB、VosA 和 VeA 从 G240 到 L331 的二聚化区域进行比对，发现该区域在这三种蛋白中大部分是保守的。在 VosA 中对应 VelB G240 和 L331 的残基分别位于 G96 和 L171，VeA 中对应 G240 的是 G83，在 180 位亮氨酸被异亮氨酸（I180）取代。

对这两种蛋白中的相应残基进行丙氨酸替换，以评估这些变化对 VeA 或 VosA 功能的影响。结果显示，VosA 中 G96A、L171A 以及双替换均导致 vosA 缺失表型，突出了它们在有性和无性条件下对 VosA 完整功能的重要性，双替换突变体还失去了长期的孢子活力，类似于 vosA 基因敲除。VeA 的情况有所不同，单个氨基酸交换不会导致明显的表型，只有双氨基酸交换的菌株在诱导有性和无性发育的条件下培养时，才表现出类似于 veA 缺失菌株的表型，包括菌落颜色变化和黑暗条件下有性结构产生受阻。这些结果表明，这两个氨基酸对 VeA、VelB 和 VosA 的功能至关重要，VelB 和 VosA 中的单个氨基酸替换会显著干扰蛋白质功能，而 VeA 中只有双替换才会诱导明显的表型效应。

1. 构巢曲霉 VelB 二聚化连接子在功能上对长度缩短有部分耐受性：分析发现，二聚化连接子高度灵活，在序列和长度上均不保守。构巢曲霉 VelB 的二聚化连接子由 31 个残基（位置 280 - 310）组成。为评估二聚化连接子长度对绒毡蛋白功能的影响，构建了具有缩短连接子的构巢曲霉 velB 突变体。

比较这些 velB 突变体的生长表型，发现一些突变体与野生型相比，表型相似或仅有轻微改变，表明构巢曲霉 VelB 二聚化连接子在功能上可以部分耐受长度缩短。例如，velB^{?LPQSDIAEVINKGTA289 - 303}突变体在测试条件下不产生任何有性子实体，类似于 velB 缺失菌株；而 velB^{?LPQSDIAEVINKGT289 - 302}突变体，虽然连接子缺失了 14 个残基，但仍能够形成有性子实体，说明突变的 VelB^{?LPQSDIAEVINKGT289 - 302}在有性发育中仍发挥一定作用。

讨论

真菌作为与动物同属后鞭毛生物的成员，在人类生活中通过多种方式发挥着重要作用，如食品生产、致病以及产生 SMs 等。与动物的进化策略相似，真菌进化出了复杂的 NF - κB 样绒毡家族调节因子，这些调节因子是一类多样的真菌转录因子，其特征是具有独特的绒毡结构域。绒毡调节因子可以形成同源和异源二聚体，在协调真菌的次生代谢、发育和分化过程中起着至关重要的作用。然而，尽管它们在真菌中广泛存在且功能重要，但绒毡蛋白发挥功能的机制在很大程度上仍未被阐明。

研究发现了真菌绒毡结构域的一般架构，包括 N 端 DNA 结合区域、可变区域以及进一步分为 α - 亚基、连接子和 β - 亚基的 C 端二聚化区域。N 端 DNA 结合区域具有很强的正电位，VosA 同二聚体和 VosA - VelB 异源二聚体的晶体结构的静电表面电位以及对构巢曲霉 VosA 中该区域的功能研究证实了四个正电荷残基（K37、K39、R41 和 K42）在蛋白质 - DNA 相互作用中的关键作用。

与其他形成二聚体的蛋白质（如 Rel/NF - κB 转录因子家族）类似，绒毡结构域包含一个保守的二聚化区域，有助于同源或异源二聚化。本研究以构巢曲霉 VelB 为模型，解析了绒毡结构域的保守架构。通过丙氨酸扫描，观察到表型和次生代谢的改变，从而确定了 VelB 二聚化区域中的两个关键残基 G240 和 L331，它们对构巢曲霉 VeA 和 VosA 的完整功能也是必需的。值得注意的是，这些 velB 突变体阻碍了有性子实体的发育以及一些黄酮类化合物（如 Emericellin、Shamixanthone 和 Epishamixanthone）的产生，这些黄酮类化合物通常在有性发育过程中积累，为有性子实体提供保护。G240 和 L331 在 VelB 中的作用进一步被证实对同源二聚化以及与 VeA 和 VosA 的异源二聚体形成至关重要。这些残基在真菌界的绒毡蛋白中高度保守，G240 存在于 98% 的分析绒毡蛋白中，L331 存在于 95% 的分析绒毡蛋白中，表明它们具有保守的功能。二聚化区域还包括一个灵活的结构域间连接子，被认为可以调节二聚体配对。本研究揭示了构巢曲霉 VelB 二聚化连接子在功能上对长度缩短有部分耐受性，因此，二聚化区域似乎是一个重要的蛋白质相互作用平台，其中每个部分在相互作用中都发挥着特定的作用。

总之，对 4999 个真菌绒毡结构域的深入生物信息学分析结合初步的功能分析，支持了绒毡结构域的一般保守架构。尽管通过构巢曲霉 VelB 模型筛选出了绒毡结构域的关键残基，但这些残基突变如何影响绒毡结构和功能仍有待阐明。未来，应进行更详细的研究，如研究关键残基突变或连接子缩短导致的 VelB 突变体的三维蛋白质结构变化、核转位、调控基因网络以及相互作用蛋白谱的变化，以进一步阐述绒毡调节网络在协调真菌发育和次生代谢中的作用，这也是真菌与环境交流的一种机制。

材料和方法

1. 在真菌界搜索绒毡蛋白：于 2021 年 5 月 12 日从 JGI MycoCosm（https://mycocosm.jgi.doe.gov/mycocosm/home）获取真菌界的基因组数据，包括子囊菌门（1102 个基因组）、担子菌门（567 个基因组）、芽枝霉门（4 个基因组）、壶菌门（34 个基因组）、隐真菌门（2 个基因组）、微孢子虫门（23 个基因组）、毛霉门（101 个基因组）和捕虫霉门（22 个基因组）。使用每个基因组的所有基因目录蛋白，以构巢曲霉 VosA 绒毡结构域（VosA 蛋白 AN1959 的 22 - 186 位）为查询序列，通过 BlastP 搜索同源物，阈值低于 E - 10，选择包含完整绒毡结构域的候选蛋白进行进一步分析。
2. 绒毡结构域的保守性计算和序列 logo 创建：使用 HMMER（版本 3.0，http://hmmer.org/）将筛选出的 4999 个绒毡蛋白（Data S1）与 Pfam 数据库（PF11754，http://pfam.xfam.org/family/PF11754）中的绒毡结构域种子进行比对，去除未比对的残基。使用 Jensen - Shannon 散度评分方法（默认参数）计算序列比对的保守性，分数越高表示保守性越强（https://compbio.cs.princeton.edu/conservation/score.html）。使用 WebLogo（版本 3，http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi）生成比对的序列 logo，在 Jalview Desktop（http://www.jalview.org/）上进行序列编辑和统计分析。
3. 构巢曲霉和大肠杆菌菌株及生长条件：本研究使用和构建的构巢曲霉菌株列于 Table S1，AGB551（veA⁺）用作构巢曲霉野生型。野生型和突变菌株在添加 0.1% 盐酸吡哆醇、5 mM 尿苷和 5 mM 尿嘧啶的基本培养基（MM，1% 葡萄糖、7 mM KCl、2 mM MgSO₄、70 mM NaNO₃、11.2 mM KH₂PO₄、0.1% 微量元素溶液，pH 5.5）中生长。菌株在含有 2% 琼脂的固体 MM 上于 37°C 光照下培养 3 天，收获 3 天龄的孢子用于进一步实验。对于表型观察，将约 200 个孢子点接种在 37°C 黑暗或光照的 MM 固体平板上并密封。大肠杆菌菌株在固体溶原肉汤（LB）培养基（1% 胰蛋白胨、0.5% 酵母提取物和 1% NaCl）或液体 LB 中，在 37°C 旋转摇床上振荡培养，添加 100 μg/mL 氨苄青霉素或 50 μg/mL 卡那霉素以防止质粒丢失。
4. 本研究中使用的寡核苷酸：本研究中