编辑推荐：
本文鉴定了一种源自致病真菌（Nigrospora aurantiaca）的新型类烟草花叶病毒（NaTLV1）。它能形成丝状病毒粒子并在烟草本氏烟（Nicotiana benthamiana）中复制，但未观察到细胞间移动。研究有助于揭示病毒起源与进化，为病毒学研究提供新视角。
引言
植物和真菌之间的寄生与共生关系已存在数百万年，二者常受多种病毒感染。多项宏基因组研究表明，部分病毒可在植物和真菌界传播，如Endornaviridae、Totiviridae等科的病毒 。Virgaviridae科部分成员也可能从植物传播至真菌。
Virgaviridae科目前分为七个属，其病毒具有（+）单链 RNA 基因组，呈杆状病毒粒子。Tobamovirus属的（+）ssRNA 线性基因组为单分体。2016 年报道了首个类烟草花叶病毒（tobamo-like virus）的完整基因组，此后又发现多种此类病毒，它们一般具有 9kb - 13kb 的（+）ssRNA 基因组，含短 poly（A）尾和三或四个开放阅读框（ORF），但此类病毒能否形成典型病毒粒子、在植物中的感染性和致病性研究较少。
丝状病毒粒子是许多（+）ssRNA 植物病毒科和部分真菌病毒的特征。Nigrospora aurantiaca是重要的子囊菌属真菌，能产生红色素和多种次生代谢产物，是经济作物的病原体。本研究从该真菌中鉴定出新型类烟草花叶病毒 NaTLV1，对其进行深入研究。
结果
- NaTLV1 全基因组测序与分析：从N. aurantiaca菌株 A4 的菌丝提取物中分离出约 10K 的单链 dsRNA 片段。经 Illumina NovaSeq 6000 测序平台测序、de novo组装，得到 NaTLV1 基因组序列。其基因组（不含 poly（A）尾）长 10,224nt，GC 含量 51.7%，含四个部分重叠的 ORF，提交至 GenBank（登录号 OR228589.1）。
- ORF1 编码病毒甲基转移酶（Mtr）和病毒 RNA 解旋酶（Hel），ORF2 编码 RNA 依赖的 RNA 聚合酶（RdRp）结构域，二者与内源性Eutypa lata类烟草花叶病毒的推定复制酶通读蛋白相似性较高，但氨基酸序列一致性仅为 37.38% 和 52.58% 。NaTLV1 的 ORF1 和 ORF2 可能通过 UAG 终止密码子通读机制产生融合蛋白。
- ORF3 编码含 DEAD 样解旋酶超家族（DEXDc）结构域的推定运动蛋白（MP），与Acidomyces richmondensis类烟草花叶病毒 1 的推定 MP 相似性最高。
- ORF4 编码推定衣壳蛋白（CP），与Mycosphaerella tobamovirus B的推定 CP 相似性最高。
- NaTLV1 的系统发育分析和基因组特征：基于 RdRp 核苷酸序列构建的系统发育树显示，NaTLV1 与其他类烟草花叶病毒聚在一个分支，在Virgaviridae科内形成独特分支，表明类烟草花叶病毒可能代表一个与Virgaviridae科密切相关的新属或新科。
- NaTLV1 及相关类烟草花叶病毒的推定 MP 与Virgaviridae科其他属的 MP 差异显著，氨基酸序列更长，且其推定 MP 与Gammaflexiviridae科的Entoleuca gammaflexivirus 1的 MP 和Potyviridae科的日本山药花叶病毒的圆柱形包含蛋白（CI 蛋白）相似，同源区域含 DEXDc 结构域。
- 基于 CP 构建的系统发育树表明，NaTLV1 与几种类烟草花叶病毒聚类，且与Gammaflexiviridae和Betaflexiviridae科的一些成员相邻，推测其衣壳形态更接近这两个科的病毒。
- NaTLV1 的传播及其对宿主真菌的影响：NaTLV1 可通过真菌分生孢子垂直传播，传播率约 50%，也可通过菌丝融合在营养亲和的真菌菌株间水平传播 。
- NaTLV1 感染对N. aurantiaca的菌落形态、大小、分生孢子形成及对N. benthamiana叶片的致病性均无显著影响。
- 与 NaTLV1 相关的病毒样粒子：通过蔗糖密度梯度超速离心从感染 NaTLV1 的N. aurantiaca菌株 A4 中纯化病毒粒子。RT - PCR 和 SDS - PAGE 分析表明，在 20% 蔗糖梯度的第 3 组分中检测到 NaTLV1 的 RNA 片段和分子量约 37.0kDa 的蛋白 p37，肽质量指纹分析显示 p37 很可能是 NaTLV1 的 CP。透射电镜观察到第 3 组分中有宽度约 37nm、长度约 1,100nm 的丝状病毒样粒子，而未感染 NaTLV1 的菌株中未发现，说明 NaTLV1 由 CP 包裹形成丝状病毒粒子。
- NaTLV1 在植物感染模型中的复制和细胞间运动：在烟草本氏烟（N. benthamiana）中研究 NaTLV1 的复制和细胞间运动。结果显示，接种叶片在接种后 1 - 14 天可检测到病毒 RNA，且病毒积累量随时间增加；但未接种的上部叶片在接种后 7 天和 14 天未检测到病毒 RNA，且在单个叶片中，NaTLV1 仅在接种区域复制，表明 NaTLV1 可在N. benthamiana叶片中复制，但未观察到细胞间运动，但不能完全排除在小样本未接种组织中存在细胞间运动的可能。
讨论
真菌和植物病毒的进化关系复杂，已有研究发现一些真菌和植物病毒可在跨 kingdom 感染，这引发了对植物和真菌病毒起源的思考。
本研究鉴定的 NaTLV1 基因组含 10,301nt，四个 ORF 和一个 poly（A）尾。基于 ICTV 分类标准和系统发育分析，NaTLV1 与Virgaviridae科关系密切，可能与其他相关类真菌烟草花叶病毒形成一个独特的属或科。
NaTLV1 的 ORF3 编码的推定 MP 与多种病毒的相关蛋白同源，且其推定 MP 比Virgaviridae科其他属的 MP 更长，含 DEXDc 结构域，这可能是其在N. benthamiana中缺乏细胞间运动的原因，也表明 NaTLV1 及部分类烟草花叶病毒可能通过重组和重配进化而来。
NaTLV1 的 ORF4 编码的推定 CP 与已知序列的核苷酸序列无同源性，但氨基酸序列与类烟草花叶病毒有同源性。系统发育分析和电镜结果表明，NaTLV1 的形态更接近Gammaflexiviridae和Betaflexiviridae科的病毒。
综上所述，NaTLV1 及其他类烟草花叶病毒可能是一个新的病毒属或科，与植物病毒科（Virgaviridae和Betaflexiviridae）和真菌病毒科（Gammaflexiviridae）密切相关，可能起源于共同祖先或在进化中发生重组。NaTLV1 的发现进一步支持了真菌和植物病毒之间的联系，拓展了对病毒多样性、分类和进化的理解。
材料和方法
- 真菌、病毒、植物和引物：感染 NaTLV1 的N. aurantiaca菌株 A4 从污染的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板中意外分离得到，NaTLV1 - 自由（V1）的同基因亚分离株通过单分生孢子分离获得。所有真菌菌株在 PDA 或马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）中于 28°C 保存。烟草本氏烟（N. benthamiana）由华中农业大学邓应天教授提供，在植物生长室中培养。引物序列见补充材料 Table S4。
- NaTLV1 RNA 提取、测序和生物信息学分析：用 EZNA Fungal RNA Kit 提取N. aurantiaca菌株 A4 的总 RNA，构建文库后在 Illumina NovaSeq 6000 平台测序。对原始读数进行过滤和组装，通过与非冗余蛋白质数据库比对鉴定类烟草花叶病毒。用 RT - PCR 和 Sanger 测序进一步确认 NaTLV1 的全长基因组，通过 5′ 和 3′RACE 获得末端片段。用 MAFFT 进行序列比对，用 IQ - TREE 构建系统发育树，用 NCBI Conserved Domain Search 进行结构域分析。
- NaTLV1 在N. aurantiaca中的水平和垂直传播及真菌菌株特征分析：将 NaTLV1 感染的 A4 菌株和未感染的 V1 菌株共培养评估水平传播，通过单分生孢子分离和 RT - PCR 检测评估垂直传播效率。观察 A4 和 V1 菌株的菌落形态、测量生长速率和分生孢子产量评估表型，通过接种N. benthamiana叶片测量病斑面积评估毒力。
- 病毒粒子和真菌接种：用机械摩擦接种和涂抹接种法将病毒粒子接种到N. benthamiana叶片，用含菌丝的凝胶塞接种N. aurantiaca菌株 A4 和 V1 到N. benthamiana叶片，接种后培养约 5 或 7 天。
- RT - PCR 确认病毒感染和 RT - qPCR：提取N. benthamiana叶片或N. aurantiaca菌丝的总 RNA，合成 cDNA 后进行 qRT - PCR，以N. benthamiana EF1α RNA 为内参，实验重复三次，每次样本分析三次，用 Jamovi 软件进行统计分析。
- 病毒粒子纯化和可视化：通过一系列离心和过滤步骤纯化病毒粒子，将纯化的病毒粒子制备物进行透射电镜观察，用 ImageJ 测量病毒粒子的长度和宽度。
- 病毒粒子 ssRNA 和蛋白质分析：用酚：氯仿：异戊醇提取法纯化各组分的 ssRNA，合成 cDNA 后进行 PCR 扩增和琼脂糖凝胶电泳。用 12% SDS - PAGE 分离各组分的蛋白质，进行考马斯亮蓝染色，对蛋白质条带进行肽质量指纹分析。
本研究得到了国家自然科学基金、首都卫生研究与发展专项基金和中央财政支持地方高校发展专项资金的支持。T.Z. 和 Y.T. 设计实验并撰写文章，M.H. 和 F.T. 进行实验和分析数据，Z.S. 和 H.L. 分析数据。
