靶向 NSP6：阻断 SARS-CoV-2 复制的新希望 ——RAB5 在病毒复制细胞器生成中的关键作用

本文聚焦 SARS-CoV-2，发现 RAB5 是其复制细胞器（ROs）生成的关键宿主依赖因子。病毒借助 COPB1，利用 RAB5+ 膜构建 ROs，NSP6 参与其中。这一成果揭示 NSP6 可作为抗 SARS-CoV-2 的潜在靶点，为抗疫研究提供新思路。

　　

引言

新冠疫情的爆发凸显了病毒跨物种传播的严重性。SARS-CoV-2 作为第七种感染人类的冠状病毒，可能起源于蝙蝠。病毒成功感染人类，除了找到合适受体和逃避宿主抗病毒防御外，还需劫持宿主细胞机制，利用宿主依赖因子进行复制。

冠状病毒进入宿主细胞后，会合成非结构蛋白（NSPs），其中 NSP3、NSP4 和 NSP6 负责重塑细胞膜，形成复制细胞器（ROs），即双膜囊泡（DMVs），病毒复制转录复合体（RTC）在此组装。目前对 SARS-CoV-2 的 ROs 研究主要集中在病毒分子参与 DMV 生物发生方面，但对其细胞起源和宿主依赖因子仍知之甚少。本研究旨在探索 SARS-CoV-2 生成 ROs 的宿主依赖因子，发现 RAB5 是关键因子，且 NSP6 在其中发挥重要作用。

结果

1. SARS-CoV-2 RNA 动力学：为确定 SARS-CoV-2 组装 RTC 的时间，研究人员检测了不同细胞系中病毒 RNA 复制动力学。用 SARS-CoV-2 香港株（HK）以感染复数（MOI）为 1 感染非洲绿猴肾上皮 VeroE6、人肺上皮 A549-ACE2 等多种细胞系，在感染后不同时间点收集细胞提取 RNA，同时收集培养上清液测定病毒滴度。结果显示，多数细胞系在感染后 6 小时可检测到新的病毒 RNA 拷贝，16HBE 细胞在 10 小时可检测到，且此时无感染性病毒粒子产生。因此，选择感染后 6 小时（16HBE 细胞为 10 小时）作为检测 RTC 亚细胞分布和测量病毒 RNA 合成缺陷的时间点。
2. 自噬对 SARS-CoV-2 RNA 合成并非必需：通过荧光显微镜观察，发现 SARS-CoV-2 的 RTC 与自噬相关膜标记（如 EGFP-LC3B、DFCP1、WIPI2 等）几乎没有重叠，Pearson 相关系数也证实了这一点。进一步通过构建 ATG5 基因敲除细胞系和使用自噬调节化合物处理细胞，结果表明自噬对 SARS-CoV-2 RNA 合成没有显著影响，仅在某些细胞系（如 A549-ACE2）的病毒生命周期后期（24 小时感染后）可能对病毒粒子组装和 / 或释放有重要作用。
3. SARS-CoV-2 RTC 与 RAB5⁺ 膜共定位：研究人员用多种细胞内膜标记物检测 SARS-CoV-2 RTC 的亚细胞分布，发现病毒 dsRNA 与早期内体标记物 RAB5 的共定位最强，平均 Pearson 相关系数达 0.8。感染后，RAB5 和 TGN46 等标记物在细胞质中更强烈且分散，这与以往研究中 SARS-CoV-2 促进高尔基体碎片化、上调 RAB5 mRNA 表达的结果一致，表明病毒可能利用内体膜构建 ROs 或招募 RAB5 到 RO 膜上。
4. RAB5⁺ 早期内体对 SARS-CoV-2 ROs 生物发生至关重要：使用抑制剂 pitstop2 和 dynasore 处理细胞，pitstop2 抑制网格蛋白寡聚化，影响早期内体维持；dynasore 抑制动力蛋白，参与受体介导的内吞作用。结果显示，pitstop2 显著降低病毒 RNA 合成，dynasore 影响较小，表明网格蛋白依赖的 RAB5⁺ 早期内体对 SARS-CoV-2 基因组复制和 ROs 生物发生是必需的。构建 RAB5 基因敲除细胞系进一步证实，RAB5 缺失显著抑制病毒 RNA 合成，减少 ROs 形成，且 RAB5 缺失不影响病毒进入细胞。
5. COPB1 对 SARS-CoV-2 RNA 合成必不可少：通过 RNA 干扰技术敲低 AP1、AP2 和 COPB1（COP-I 复合体的一个组分），以及表达 VPS4 的显性负突变体（VPS4_E228Q），发现只有 COPB1 敲低会显著影响 SARS-CoV-2 基因组复制。在 16HBE 细胞中敲除 COPB1 以及用 COPI 复合体抑制剂处理细胞，均证实 COPB1 在病毒 RNA 合成中的重要作用，且 COPB1 不影响病毒进入细胞。
6. SARS-CoV-2 NSP6 与 RAB5 和 COPB1 相互作用：NSP6 是冠状病毒构建和维持 ROs 的关键蛋白。研究发现，NSP6-HA 与病毒 RTC 共定位，且与病毒 RdRp 共免疫沉淀，还与早期内体组分共纯化。通过免疫沉淀和荧光显微镜实验，证实 NSP6 与 RAB5 和 COPB1 相互作用，NSP6 的 C 末端域与 RAB5 相互作用，N 末端域与 COPB1 相互作用，且 NSP6 能增强 RAB5 和 COPB1 之间的相互作用。

讨论

SARS-CoV-2 可能利用广泛存在于哺乳动物中的细胞因子进行 ROs 生物发生，从而实现跨宿主传播。本研究表明，自噬对 SARS-CoV-2 RTC 组装并非必需，这与之前一些关于其他冠状病毒利用自噬膜构建 ROs 的研究不同。虽然 SARS-CoV-2 RTC 与高尔基体、脂滴和线粒体有一定程度共定位，但早期内体标记物 RAB5 与 RTC 共定位最强，且对病毒基因组复制至关重要。

SARS-CoV-2 可能通过两种方式利用 RAB5⁺ 膜：重新定位 RAB5 到 RO 膜或利用早期内体（RAB5⁺ 膜）生成 ROs。实验结果更支持后者，且内吞小泡不是主要来源。NSP6 在其中发挥重要作用，它与 RAB5 和 COPB1 相互作用，可能通过 COPI 依赖的方式在 ER 与内体的接触位点招募内体膜。

研究还存在一些未解决的问题，如病毒为何选择早期内体膜以及是否利用高度保守的细胞因子进行 ROs 生物发生。推测利用早期内体膜可能有助于病毒逃避先天免疫传感器的识别，且内吞作用和囊泡运输在哺乳动物中高度保守，这可能为病毒在不同宿主中复制提供了适宜环境，促进了其传播和适应。

材料和方法

详细方法见补充材料。实验涉及多种质粒构建，包括编码 SARS-CoV-2 开放阅读框（ORFs）的质粒、HA 标记的 NSP6 构建体等。细胞培养和转染按照既定方案进行，使用 GenJet 体外 DNA 转染试剂或 Lipofectamine 3000 转染试剂。通过 esiRNA 寡核苷酸敲低目标基因，用 XTT 法检测细胞活力。在生物安全三级（BSL3）实验室进行 SARS-CoV-2 感染实验，用不同细胞系感染病毒，检测 RNA 动力学、病毒滴度等。还进行了荧光素酶报告基因检测、RT-qPCR、免疫沉淀和 western blotting、内体分级分离、荧光显微镜和电子显微镜观察等实验，并使用相应统计方法分析数据。