重大发现！生化图谱揭示细菌细胞色素 c 生物合成系统 I 中 CcmCD 介导的保守血红素转运机制

这篇研究聚焦细菌细胞色素 c 生物合成系统 I，利用半胱氨酸 / 血红素交联等技术，发现 CcmCD 是血红素转运蛋白，其具有血红素接受域和转运通道，且通道结构保守。这为理解血红素转运机制提供关键线索，对生命科学研究意义重大。

　　

引言

血红素（Heme）是一种在生命活动中至关重要的氧化还原活性辅因子，参与气体传感、运输、电子转移等过程，但它的氧化还原特性也使其具有细胞毒性，因此细胞内血红素的平衡和运输需要严格调控。目前虽已鉴定出一些血红素转运蛋白，如真核生物中的 FLVCRs、HRGs、MRPs，细菌中的 Has、Phu、Shu、Isd 等摄取途径相关蛋白以及 HrtAB、CydDC 等输出蛋白，但血红素运输的生化机制仍不清楚。

细胞色素 c 的合成需要血红素辅因子的共价结合，这一过程由 System I、System II、System III 三条途径介导。其中，System I 存在于 α -、γ - 变形菌、植物和原生动物线粒体以及古细菌中，由 CcmABCDEFGH 组成。在大肠杆菌的 System I 途径中，CcmABCD 负责将血红素跨膜运输到周质的 CcmC WWD 结构域，随后血红素与 CcmE 结合形成 holoCcmE，holoCcmE 再将血红素转移到全细胞色素 c 合酶 CcmFH，最终与脱辅基细胞色素 c 结合。然而，血红素如何传递到 CcmC WWD 结构域的机制尚不清楚。本文聚焦于此，利用半胱氨酸 / 血红素交联技术，对 System I 途径中 CcmCD 的血红素运输通道进行生化定位，以揭示血红素运输的机制。

结果

1. System I 血红素运输的新见解：研究发现，在缺乏 CcmAB 的情况下，CcmCDE 仍能与 holoCcmE 一起纯化，这表明 CcmAB 并非血红素接受、跨膜运输到 CcmC WWD 结构域以及与 CcmE 结合所必需的。基于此，研究人员推测 CcmCD 是 System I 的血红素转运蛋白，并利用 CcmCDE (H130A) 复合物来研究血红素的接受和运输机制。通过 AlphaFold 3 预测，发现 CcmCD 除了已知的 WWD 结构域与血红素结合外，在细胞质面还存在另一个血红素相互作用域，同时 CAVER 3.0.3 预测了一条通过 CcmC 的潜在运输通道，该通道与 AlphaFold 3 预测的血红素位置相符。
2. CcmC - 血红素相互作用的鉴定：为验证 CcmCD 作为血红素转运蛋白的假设，研究人员采用半胱氨酸 / 血红素交联方法。该方法利用半胱氨酸和血红素在接近时形成共价键的特性，通过在 GST:CcmCDE (H130A) 中构建 38 个 CcmC 的单氨基酸半胱氨酸变体，经重组表达、亲和纯化和 SDS - PAGE 分析，发现 8 个 CcmC 半胱氨酸变体（M68C、A97C、I143C、L145C、R152C、V163C、L170C、L227C）形成了半胱氨酸 / 血红素交联。通过血红素染色、UV - vis 光谱分析、吡啶血红素分析等进一步验证了交联的形成，结果表明这些变体与野生型相比，能保留更多的血红素，且血红素环境未受明显扰动，大部分共纯化的血红素为 b 型，少量在半胱氨酸 / 血红素交联处捕获。
3. CcmD 与血红素的相互作用：由于 CcmD 的缺失会影响 holoCcmE 的含量，研究人员推测 CcmD 可能参与血红素运输。为此，他们在 GST:CcmCDE (H130A) 中构建了 13 个 CcmD 的单氨基酸半胱氨酸变体，经筛选发现 2 个变体（Y17C、I46C）形成了半胱氨酸 / 血红素交联。通过构建 GST:CcmC (D:flag) E (H130A) 进一步验证了交联的形成，且发现 CcmD:flag 不影响细胞色素 c 生物合成。将 CcmCD 半胱氨酸变体引入完整的 System I 途径中，研究其对细胞色素 c 生物合成的影响，结果发现部分变体功能正常，部分部分功能受损，但所有变体共纯化的总血红素水平与野生型相当或更高，表明变体生物合成缺陷并非由于无法接受或与血红素相互作用，而是可能由于半胱氨酸 / 血红素交联导致的血红素分布不均。
4. CcmCD 血红素通道：将半胱氨酸 / 血红素交联残基映射到 CcmCD 的冷冻电镜结构上，确定了一个血红素接受域和血红素通道。血红素接受域由 CcmC 跨膜结构域（TMD）4/5/6 和 CcmD 的 I46C 组成，位于蛋白质的细胞质面。血红素通道由 CcmC 的 TMD 2/3/4/5 组成，分为上下两个通道簇，分别由不同的半胱氨酸 / 血红素交联残基定义。该通道位于 CcmC WWD 结构域下方，血红素通过该通道运输到 WWD 结构域进行特异性定位和与 CcmE 结合。进一步分析发现，血红素接受域和通道主要为疏水性，这与其他血红蛋白中血红素相互作用基序的分析结果一致。通过测定血红素氧化还原电位，发现血红素在 CcmCD 血红素通道中保持还原状态，这与 System II 中 CcsBA 的血红素跨膜运输机制相似，即血红素在运输过程中受到保护不被氧化。
5. CcmCD 血红素通道的结构保守性：通过对 44 种编码 System I 的生物的 CcmC 和 CcmD 序列进行分析，发现 CcmC 的 WWD 结构域高度保守，部分血红素通道半胱氨酸 / 血红素交联残基也具有较高的保守性，而 CcmD 的序列保守性和蛋白质大小变化较大，其半胱氨酸 / 血红素交联残基不保守。对代表性病原体的结构分析表明，尽管 CcmCD 的整体序列同源性较低，但血红素运输通道在结构上是保守的，这表明存在一种保守的跨细菌内膜的血红素运输机制。

讨论

本研究解决了长期以来关于 System I 中血红素从细胞质跨细菌膜运输到 CcmC WWD 结构域的问题。生化证据表明，CcmCD 具有细胞质血红素接受域和跨膜血红素通道，是 System I 中可能的血红素转运蛋白。血红素传递到 CcmCD 的机制尚不清楚，研究人员更支持血红素伴侣传递模型，即血红素由血红素生物合成的末端酶或不稳定血红素池通过可溶性血红素伴侣传递给 CcmCD。CcmD 在血红素接受中起作用，但不参与跨膜运输，其在周质空间的 Y17C 高度保守，暗示周质区域在血红素相互作用中具有保守作用。

此外，CcmCD 介导的血红素运输是能量独立的，与典型的 ABC 转运蛋白不同，ATP 水解不是血红素运输到 CcmC WWD 结构域所必需的，而是介导 holoCcmE 从 CcmABCD 亚复合物中释放。研究人员推测，血红素通道的疏水性以及 CcmC 的潜在构象变化可能促进血红素运输，CcmE 与 CcmCD 的相互作用或血红素与 CcmE 的结合可能介导这些变化。总之，本研究为理解血红素运输机制提供了重要线索，对生命科学领域的研究具有重要意义。

材料和方法

1. 细菌生长条件：大肠杆菌菌株在含有适当抗生素（如羧苄青霉素 50 μg/mL、氯霉素 20 μg/mL）和 / 或诱导试剂（如异丙基 - D 1 - 硫代半乳糖吡喃糖苷 [IPTG] 1.0 或 0.1 mM、L - 阿拉伯糖 0.2% [wt/vol]）的 Luria - Bertani（LB）肉汤中，于 37°C、200 rpm 条件下培养。
2. 半胱氨酸变体质粒的构建：在大肠杆菌 NEB - 5α 中进行克隆，通过 QuikChange II 定点突变技术构建单氨基酸半胱氨酸取代和 C 末端 CcmD:flag 融合，经 DNA 测序验证。
3. 蛋白质纯化：对 GST:CcmCDE (H130A) 进行亲和纯化，方法参考先前研究并略有修改。
4. SDS - PAGE 分离和膜转移：蛋白质样品经 12.5% 或 15% 的 SDS - PAGE 分离，在特定电压下电泳一定时间，血红素染色分析经湿转法转移到 0.2 微米硝酸纤维素膜，免疫印迹经半干转法转移到 0.45 微米硝酸纤维素膜。
5. 血红素染色、免疫印迹、定量和统计分析：对 5 或 10 μg 亲和纯化的蛋白质样品进行血红素染色，对 5 μg 样品进行免疫印迹，使用特定抗体进行检测，利用 Azure Sapphire Biomolecular Imager 成像，通过 AzureSpot Software 进行定量分析，计算交联血红素与总 “游离” 血红素的比例并归一化到野生型，使用 GraphPad Prism v10.4.1 进行统计分析。
6. UV - vis 光谱分析：使用 UV - 1900i 和 LabSolutions 软件收集 UV - vis 吸收光谱，方法如先前所述。
7. CcmCD 结构预测和建模：利用 CAVER 3.0.3 PyMOL 插件预测 CcmCD 的血红素通道，在 PyMOL 中分析 CcmCD 的疏水性，通过 AlphaFold 3 DB 获取其他细菌的 CcmCD 结构预测，用 PyMOL 计算预测结构与 CcmCD（PDB 7F04）的均方根偏差（RMSD）。
8. CcmC 和 CcmD 序列保守性分析：从 UniProt 和 NCBI 数据库获取 CcmCD 多肽的 FASTA 氨基酸序列，以大肠杆菌 CcmC 氨基酸序列为查询进行 BLASTp 搜索，收集编码 System I 蛋白的生物序列，去除无法获取 CcmC 和 CcmD 序列的门类。使用 CLUSTAL O 软件进行多序列比对，通过 UniProt 接口获取序列同一性百分比，用 JalView 软件分析氨基酸保守性和氨基酸性质保守性。
9. 体内细胞色素 c 生物合成测定和统计分析：将 CcmC 和 CcmD 半胱氨酸变体构建到完整的 System I 途径中，与细胞色素 c₄:His 共表达，通过血红素染色监测细胞色素 c 生物合成，具体方法参考先前研究。
10. 血红素氧化还原电位的测定：采用先前描述的改良 Massey 方法测定血红素氧化还原电位。