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本文聚焦牙周炎，发现口腔病原体（如具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌等）与炎症细胞因子（如 TNF、IL - 1α 等）可协同诱导牙龈成纤维细胞（GFs）中 COX - 2 表达及 PGE2分泌，该过程依赖 TLR2 和 p38 MAPK，还能促进巨噬细胞 IL - 8 表达，为牙周炎研究提供新视角。
引言
在口腔黏膜中，成纤维细胞是数量丰富的细胞群体之一，它们不仅维持组织的结构和完整性，还作为哨兵细胞，对炎症有着高度的反应性。在牙周炎这种慢性炎症性疾病中，牙龈成纤维细胞（GFs）的免疫功能尤为明显。牙周炎严重时会影响超过 10% 的成年人口，不仅会导致牙齿缺失，还与多种全身性疾病相关，如类风湿关节炎、阿尔茨海默病、心血管疾病、糖尿病和癌症等。目前认为，牙周炎由微生物失衡（生态失调）引发，导致免疫系统持续激活，大量活化的中性粒细胞被募集，从而造成牙周组织的严重损伤。近期单细胞转录组研究发现，GFs 对中性粒细胞的募集具有特异性高反应性，这进一步证实了成纤维细胞与中性粒细胞之间的相互作用在牙周炎免疫病理过程中的关键作用。
前列腺素 E2（PGE2）是一种由多种细胞（包括 GFs）释放的脂质介质，在牙周炎的发病机制中起着重要作用。在 PGE2的生物合成过程中，花生四烯酸首先在环氧化酶（包括组成型表达的 COX - 1 和诱导型的 COX - 2）的作用下转化为前列腺素 H2（PGH2），随后 PGH2在 PGE 合成酶（尤其是微粒体前列腺素 E 合成酶 - 1，mPGES - 1）的作用下转化为 PGE2。虽然 PGE2通常被认为是与急性炎症相关的介质，但越来越多的证据表明它在慢性炎症性疾病中也有着重要作用。在牙周炎患者的牙龈组织中，COX - 2 水平相较于健康对照有所升高，同时在牙周炎患者的龈沟液（GCF）中也观察到 PGE2浓度增加，且与牙龈炎症和临床参数相关。此外，编码 COX - 2 的 PTGS2 基因多态性以及 PTGS2 启动子甲基化水平的改变都与牙周炎有关。在动物模型中，应用 PGE2受体 EP4 的特异性拮抗剂、不同选择性的 COX - 2 抑制剂或 mPGES - 1 抑制剂，都能通过抑制破骨细胞生成，有效预防牙槽骨丢失。
在 GFs 中，COX - 2 的表达和 PGE2的产生会被多种与牙周炎发病相关的因素上调，包括炎症细胞因子、口腔病原体（如牙龈卟啉单胞菌和缠结丝状杆菌）以及细菌毒力因子（如脂多糖和牙龈卟啉单胞菌衍生的菌毛）。然而，以往仅研究 GFs 对单一因素的反应，可能无法反映细胞在面对炎症牙龈组织中多种宿主和细菌来源的炎症刺激时的真实反应，也可能低估 COX - 2 和 PGE2的调控范围。例如，牙龈卟啉单胞菌的脂多糖单独作用时对 GFs 的激活作用较弱，但与白细胞介素（IL） - 1β 协同作用时，能增强 GFs 的细胞因子产生。在本研究中，研究人员全面分析了三种在牙周炎中起不同作用的口腔细菌（具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌和缠结丝状杆菌）与多种炎症细胞因子在调控 GFs 中 COX - 2 和 PGE2表达方面的相互作用，发现细菌与细胞因子之间存在强烈的协同作用，并揭示了其潜在机制和功能后果。
结果
- 口腔细菌和炎症细胞因子协同诱导 GFs 中 COX - 2 表达和 PGE2产生
为探究口腔细菌和炎症细胞因子在调节 COX - 2 - PGE2轴方面的潜在相互作用，研究人员用两种典型的口腔病原体（牙龈卟啉单胞菌 ATCC 33277、缠结丝状杆菌 ATCC 35896）和具核梭杆菌（ATCC 10953），在有无肿瘤坏死因子（TNF，在牙周炎患者牙龈组织中大量存在的细胞因子）的情况下感染 GFs。结果发现，每种测试细菌都能增强 TNF 诱导的 COX - 2 mRNA 表达。细菌与 TNF 的相互作用在 COX - 2 蛋白水平上表现出更显著的差异，GFs 在同时受到 TNF 刺激和具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌（程度稍弱）感染时，COX - 2 呈现协同诱导表达。而且，这种 COX - 2 诱导的增强效应与感染和刺激的时间顺序无关，表明口腔病原体的暴露足以使 GFs 在后续受到炎症刺激时，对 COX - 2 的诱导产生增强反应。
与 COX - 2 蛋白水平的变化一致，研究人员观察到在同时受到 TNF 刺激和具核梭杆菌或牙龈卟啉单胞菌感染的 GFs 中，PGE2的产生也出现协同增加，其中具核梭杆菌的作用更为显著。因此，在后续的大多数实验中，具核梭杆菌被用作研究口腔细菌与 TNF 在调节 COX - 2 - PGE2轴方面协同作用的模型。
为验证观察到的 COX - 2 - PGE2轴的协同激活是否仅针对 TNF，研究人员分析了几种参与牙周炎发病机制的细胞因子（IL - 1β、IL - 1α 和干扰素 - α，IFNα）的作用。结果显示，所有测试的细胞因子在与具核梭杆菌同时作用于 GFs 时，都能促进 COX - 2 蛋白的积累，这表明这种 COX - 2 的调节模式在牙周炎炎症组织中，GFs 与多种炎症介质和病原体的相互作用中具有普遍性。
2. 口腔细菌和炎症细胞因子对 COX - 2 的协同诱导作用具有成纤维细胞特异性且依赖 TLR2 激活
接下来，研究人员测试了口腔病原体和 TNF 对 COX - 2 - PGE2轴的协同激活作用是否为 GFs 所特有，还是在牙龈组织中的多种免疫和非免疫细胞类型中都普遍存在。研究人员首先以单核细胞来源的巨噬细胞（MDMs）为模型，分析了巨噬细胞中 COX - 2 的调节情况。TNF 刺激对 MDMs 中 COX2 mRNA 表达的影响较小，且对牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌诱导的 COX2 转录水平没有显著影响。同样，TNF 刺激 MDMs 不会引起 COX - 2 的明显诱导，对牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌诱导的 COX - 2 蛋白水平也没有影响。
随后，研究人员用口腔细菌在炎症细胞因子存在的情况下感染牙龈上皮细胞系 TIGK（端粒酶永生化牙龈角质形成细胞），与 MDMs 类似，没有观察到细菌和细胞因子在诱导 COX - 2 方面的协同作用。虽然 TNF 和牙龈卟啉单胞菌单独作用时能显著上调 TIGKs 中的 COX - 2，但两者联合作用并没有导致 COX - 2 蛋白的进一步积累。
最后，研究人员比较了 GFs 和来自健康皮肤标本的真皮成纤维细胞（DFs）中 COX - 2 的调节情况，发现用具核梭杆菌在 TNF 存在的情况下感染这两种细胞类型，都能导致几乎相同的 COX - 2 协同诱导表达。这表明细菌和 TNF 对 COX - 2 的协同诱导作用并非 GFs 所特有，而是成纤维细胞的普遍特征，与细胞来源无关。相比之下，巨噬细胞或上皮细胞中不存在这种 COX - 2 调节模式。
为深入了解病原体识别过程中特定受体和其他分子对细胞因子和细菌协同诱导 GFs 中 COX - 2 表达的贡献，研究人员分析了 GFs、TIGKs 和 MDMs 在受到 TNF、IL - 1β、IL - 1α 或 IFNα 刺激时，TLR2、TLR4、NOD2、MYD88、CGAS 和 STING1 的 mRNA 表达谱。虽然没有发现所有分析细胞因子在 GFs 中诱导的共同调节模式，但发现 toll 样受体 - 2（TLR2）在 GFs 中的基础表达相较于 MDMs 或 TIGKs 非常低，但能被 TNF 强烈上调。一致地，在 GFs 中，TLR2 的蛋白水平（而非 MYD88）在有无具核梭杆菌感染的情况下，都会随着细胞因子的刺激发生动态调节。相比之下，在 TIGKs 和 MDMs 中，TLR2 蛋白表达受细胞因子和具核梭杆菌的影响较小。基于这些观察结果，以及 TLR2 在口腔病原体激活 GFs 过程中的既定作用，研究人员分析了 TLR2 和 TLR4（作为参考）在 COX - 2 协同上调中的作用。结果发现，用 TLR2 中和抗体预处理 GFs，能显著抑制同时受到 TNF 刺激和具核梭杆菌感染的细胞中 COX - 2 蛋白的诱导，而应用 TLR4 阻断抗体对 COX - 2 表达的影响较小，且未达到统计学意义。
3. p38 MAPK 激活驱动口腔细菌和炎症细胞因子对 COX - 2 - PGE2轴的协同诱导
为确定口腔细菌和 TNF 协同诱导 COX - 2 的分子机制，研究人员分析了丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路成分的作用，其中许多成分是 COX - 2 - PGE2轴的重要调节因子。研究人员使用了一组针对 p38、c - Jun N 末端激酶（JNK）和细胞外信号调节激酶（ERK）的小分子抑制剂，并通过分析 MAPK 激活蛋白激酶 2（MAPKAPK2，p38 的下游分子）、c - Jun（JNK 的下游分子）和 ERK 的磷酸化水平，证实了这些抑制剂在 TNF 刺激的 GFs 中的选择性。虽然测试的 MAPK 抑制剂对具核梭杆菌或 TNF 单独诱导的 COX - 2 蛋白水平有不同影响，但只有抑制 p38 能显著抑制同时受到刺激和感染的 GFs 中 COX - 2 的协同诱导。同样，p38 抑制也能阻止 TNF 在牙龈卟啉单胞菌感染存在时对 COX - 2 的上调作用。与对 COX - 2 蛋白诱导的影响一致，p38 抑制剂几乎完全阻断了在牙龈卟啉单胞菌或具核梭杆菌感染期间受到 TNF 刺激的 GFs 中 PGE2的产生。
4. 暴露于口腔细菌和细胞因子的 GFs 分泌的 PGE2促进巨噬细胞中 IL - 8 的表达
在牙周炎受累的牙龈组织中，GFs 与免疫细胞（尤其是单核细胞和巨噬细胞）的相互作用调节着针对口腔病原体的免疫反应的多个方面。因此，为验证口腔细菌和 TNF 协同诱导 GFs 中 PGE2的功能后果，研究人员建立了一个实验系统，用在有无 TNF 存在的情况下感染具核梭杆菌的 GFs 的条件培养基刺激 MDMs。首先，研究人员证实外源性 PGE2能显著增强 TNF 在 MDMs 中诱导的 IL8 mRNA 表达，这与之前在外周血单个核细胞（PBMCs）中的观察结果一致。
为测试 GFs 条件培养基对 MDMs 中 IL8 的调节是否依赖 PGE2，研究人员在感染和刺激前，用小干扰 RNA（siRNA）沉默 GFs 中的 COX2。通过蛋白质免疫印迹证实了 COX - 2 的敲低效率。当 MDMs 在 TNF 存在的情况下，用转染了对照 siRNA 的 GFs 的条件培养基刺激时，观察到条件依赖性的 IL8 诱导：与仅用细菌感染或 TNF 刺激的 GFs 的条件培养基相比，用同时感染具核梭杆菌和受到 TNF 刺激的 GFs 的条件培养基刺激的 MDMs 中，IL8 的表达显著更高。当 MDMs 用缺乏 COX2 表达的 GFs 的条件培养基处理时，这种效应显著减弱，证实了观察到的 GFs 与巨噬细胞之间的相互作用部分依赖于 PGE2。这些结果确定了牙周炎中免疫 - 基质相互作用的一种潜在新机制，即由口腔细菌和炎症组织环境协同诱导 GFs 中 PGE2的产生，进而促进巨噬细胞中 IL - 8 的表达。
讨论
近年来，随着单细胞转录组学的发展，成纤维细胞生物学取得了显著进展。研究发现了特定成纤维细胞群体在健康和疾病中的独特作用，包括详细描述了成纤维细胞对器官特异性免疫反应的贡献，以及分别鉴定出参与类风湿关节炎和特应性皮炎发病机制的滑膜和皮肤成纤维细胞的特定亚群。同样，在人类口腔屏障组织中也发现了成纤维细胞群体的异质性。单细胞水平对健康和牙周炎受累口腔黏膜的比较揭示了 GFs 在中性粒细胞募集到炎症牙龈组织中的核心作用。在本研究中，研究人员发现了 GFs 与中性粒细胞之间相互作用的新机制，该机制涉及口腔细菌和炎症细胞因子对 COX - 2 - PGE2轴的协同诱导，这可能会增强巨噬细胞中中性粒细胞趋化因子 IL - 8 的产生。
PTGS2 基因的转录受到多种宿主来源和外部因素的动态调节，这些因素激活不同的受体和细胞内信号通路，它们之间的相互作用可能导致 COX - 2 表达的显著变化。在其他细胞类型中也有 COX - 2 协同上调的报道，如在周围血巨噬细胞中，CD40 配体与单核细胞趋化蛋白 - 1 协同作用可上调 COX - 2，导致 PGE2依赖性的血管内皮生长因子产生增加；在肺成纤维细胞和血管平滑肌细胞中，IL - 1β 与血管紧张素 II 协同诱导 COX - 2 表达。在 GFs 中，同时用 TNF 和 IL - 1β 刺激也会导致 COX - 2 和 PGE2的协同诱导，且外源性 PGE2能增强 TNF 诱导的 GFs 中 COX - 2 和 mPGES - 1 的表达，表明 PGE2的产生存在正反馈调节，可能涉及活化 GFs 对自身分泌的 PGE2的自分泌反应。此外，也有报道表明细菌毒力因子和宿主来源的介质可协同诱导 COX - 2，如在人肠道肌成纤维细胞中，大肠杆菌的脂多糖与 IL - 17 同时刺激可增强 COX - 2 表达和 PGE2释放，在牙髓成纤维细胞中，TLR2 的激活与组胺协同上调 COX - 2。然而，本研究首次证明了活细菌与炎症细胞因子在诱导 COX - 2 - PGE2轴方面的协同相互作用是成纤维细胞群体特有的。研究数据还表明，在 GFs 识别口腔病原体的过程中，TLR2 的参与对于具核梭杆菌和 TNF 在 COX - 2 诱导中的协同作用至关重要，这与之前关于 TLR2 在具核梭杆菌激活宿主细胞中的关键作用的研究一致。虽然研究人员没有评估 TLRs 对 TNF 与牙龈卟啉单胞菌或缠结丝状杆菌之间协同作用的贡献，但值得注意的是，这两种病原体也已知能激活 TLR2。
尽管 PGE2在牙周炎发病机制中起着重要作用，但直接靶向 COX - 2 似乎并不是一种有前景的治疗策略。非甾体抗炎药（NSAIDs），无论是针对两种 COX 同工型还是选择性 COX - 2 抑制剂，在多项临床试验中作为常规非手术牙周治疗的辅助手段进行测试，虽然能使疾病活动的临床参数有显著但较小的改善，并减少牙槽骨丢失，但长期使用这些化合物会带来较高的副作用发生率，包括严重的心血管不良事件，这限制了它们作为牙周炎抗炎辅助治疗的广泛应用。
相比之下，通过靶向 COX - 2 表达的上游调节因子来调节 GFs 中过量的 PGE2产生可能更具潜力。研究数据表明 p38 MAPK 在刺激 COX - 2 - PGE2轴中起着核心作用，这与其他研究中 p38 激活在牙髓成纤维细胞和肺成纤维细胞中协同诱导 COX - 2 的作用一致，尽管 COX -
