铜绿假单胞菌 Pil-Chp 表面感知系统中，拮抗反应调节因子对受体甲基化的空间调控机制及意义

本文聚焦铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的 Pil-Chp 表面感知系统。研究发现 PilK 和 ChpB 分别对 PilJ 化学受体进行甲基化和去甲基化，且受 PilG 和 PilH 调控定位到细胞两极。这一机制影响 cAMP 生成和抽搐运动反转，为理解细菌感知适应提供新视角。

　　

研究背景

化学感应系统广泛存在于细菌中，是复杂的信号转导途径，能帮助细菌应对不断变化的环境。在大多数细菌化学感应系统中，可逆的甲基接受趋化蛋白（MCPs）甲基化可能对信号调节至关重要。以大肠杆菌的鞭毛介导趋化系统为例，MCPs 的可逆甲基化可调节其信号活性，是感官适应的分子基础。然而，对于控制其他细胞功能的化学感应系统中 MCPs 甲基化的作用，人们知之甚少。

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种重要的机会性人类病原体，其编码四个化学感应系统，本研究聚焦其中的 Pil-Chp 系统。该系统包含与大肠杆菌趋化系统相似的组件，如 MCP（PilJ）、组氨酸激酶（ChpA）、两个 CheY 样反应调节因子（PilG 和 PilH），还编码预测的甲基转移酶（PilK）和甲酯酶（ChpB）。但 Pil-Chp 系统的输入信号和生物学输出与大肠杆菌趋化系统不同，它通过极向定位的 IV 型菌毛（TFP）响应表面接触，输出为抽搐运动和环磷酸腺苷（cAMP）的产生 。cAMP 可调节 200 多个基因的转录，参与急性毒力和 TFP 生物合成。Pil-Chp 信号转导对铜绿假单胞菌在表面相关生活方式的早期阶段至关重要。

研究目的

探究 MCPs 甲基化在铜绿假单胞菌 Pil-Chp 系统中的作用，明确 PilJ 甲基化对 Pil-Chp 信号转导的影响，以及相关调节因子在其中的调控机制。

实验方法

1. 菌株构建：通过两步等位基因交换，使用自杀载体 pEX18_Amp或 pEX18_Gent对铜绿假单胞菌进行基因删除或整合，构建各种突变菌株。利用标准的 Gibson 组装或定点突变协议构建质粒，并通过与大肠杆菌 S17.1 结合或电穿孔将其导入铜绿假单胞菌细胞。
2. 功能检测
   • 抽搐运动检测：采用亚表面穿刺试验，将单菌落穿刺到 1% LB 琼脂中，培养后测量抽搐运动区域的直径，计算相对抽搐运动区域。
   • cAMP 定量：使用报告质粒 pUC18-PlacP1/POXB20，通过流式细胞术测量黄色荧光蛋白（YFP）荧光强度来定量 cAMP 水平。
   • 甲基化免疫印迹：对表达 3xFlag-PilJ 的菌株进行处理，通过 SDS-PAGE 凝胶电泳和免疫印迹，使用抗 FLAG 抗体检测和量化 PilJ 的甲基化水平。
   • 免疫印迹：对表达 mNG 蛋白融合物的菌株进行处理，通过 SDS-PAGE 凝胶电泳、免疫印迹，使用抗 mNG 抗体检测蛋白表达和大小。
   • 蛋白质纯化：从 Nico21 (DE3) 细胞中表达和纯化 His-PilG，通过镍琼脂糖珠亲和层析进行纯化，并用 SDS-PAGE 电泳和 WB 评估表达情况。
   • 圆二色谱：对纯化的 His-PilG、His-PilG_D58A和 His-PilG_D58E进行圆二色谱分析，评估其二级结构特征。
   • 荧光显微镜：使用倒置尼康 TiE 荧光显微镜，通过荧光显微镜观察和分析蛋白质的定位和动态变化。
3. 数据分析：使用 Python、MATLAB 等软件对实验数据进行分析，通过计算极定位指数、不对称指数等指标，量化蛋白质的定位情况；采用单因素方差分析（ANOVA）和 Tukey 事后检验判断数据的统计学意义。

实验结果

1. PilK 和 ChpB 调节表面生长过程中 PilJ 的甲基化：通过免疫印迹分析发现，PilJ 在体内发生甲基化，且表面生长 2 小时后甲基化水平显著增加。ΔpilK和 ΔpilKΔchpB菌株中仅观察到未甲基化的 PilJ，而 ΔchpB菌株中甲基化的 PilJ 更丰富。将pilK和chpB替换为催化位点突变体后，表型与相应的缺失突变体相似，表明 PilK 和 ChpB 的酶活性控制着 Pil-Chp 系统中 PilJ 的甲基化。
2. PilK 和 ChpB 在抽搐的铜绿假单胞菌细胞中定位到相反的极点：通过量化荧光信号和计算相关指数，发现 ChpB-mNG 从细胞接触表面开始就定位到极点，且在大多数细胞中呈不对称分布；mNG-PilK 在初始表面接触时极荧光较弱，2 小时后增强，也主要定位到一个细胞极点。进一步研究表明，ChpB-mNG 优先定位到抽搐细胞的领先极点，mNG-PilK 优先定位到滞后极点，且在抽搐运动反转时，它们会分别切换到新的滞后和领先极点。
3. PilG 是 ChpB 定位到领先极点所必需的：研究发现，ChpB 不调节 PilG 的定位，但 PilG 对 ChpB-mNG 的极定位至关重要，在 ΔpilG突变体中，ChpB-mNG 的极定位被消除。此外，PilG 的磷酸化能力对 ChpB 定位到领先极点也很关键，pilG_D58A和pilG_D58E突变体中 ChpB 的极定位显著降低。PilH 通过影响 PilG 的不对称分布，间接影响 ChpB 在领先极点的积累，在 ΔpilH突变体中，ChpB 的不对称指数增加。
4. PilG 与 ChpA 结合以定位 ChpB：研究表明，FimL 不影响 ChpB 的极定位，而 ChpA 的缺失会消除 ChpB 的极定位。在ΔcpdAchpA_LOF突变体中，ChpB 的极定位与ΔcpdA对照无差异，说明与 ChpA 结合的 PilG 池有助于 ChpB 定位到领先极点。
5. PilG 排除 PilK 从极点积累：ChpB 的缺失对 mNG-PilK 的定位影响较小，而在 ΔcpdAΔpilG和 ΔcpdAΔpilGΔpilH突变体中，PilK 呈双极定位；在 ΔpilH突变体中，PilK 呈细胞质定位，且这种定位变化与 cAMP 水平无关。此外，PilG 必须具有磷酸化能力才能排除 PilK 从极点积累，pilH的磷酸化状态也会影响 PilK 的定位，这些结果表明 PilG 和 PilH 协同作用，将 PilK 定位到滞后极点。
6. PilG 和 PilH 调节 PilJ 甲基化：在 ΔpilG突变体中，PilJ 的甲基化水平增加，且这种增加依赖于 PilK，在没有 ChpB 时增强；在 ΔpilH和pilH_LOF突变体中，PilJ 的甲基化水平降低，在pilH_GOF突变体中，PilJ 的甲基化水平增加。这表明 PilG 和 PilH 通过调节 PilK 和 ChpB 的定位来调节 PilJ 的甲基化。
7. PilK 和 ChpB 调节 cAMP 产生的幅度：通过量化不同菌株在液体和表面生长时的 cAMP 水平，发现 ΔpilK菌株中，未甲基化的 PilJ 仍能感知表面接触，但 cAMP 峰值幅度略有降低；ΔchpB菌株中，甲基化的 PilJ 更有效地感知表面接触，cAMP 水平在所有时间点均高于野生型。这表明 PilJ 的甲基化状态对调节 cAMP 产生的幅度很重要。
8. PilK 和 ChpB 促进抽搐运动反转：测量 ΔpilK和 ΔchpB突变体中单个抽搐细胞的反转频率，发现它们的反转频率略低于野生型，在高 cAMP 背景下，ΔcpdAΔpilK或 ΔcpdAΔchpB突变体的反转频率显著降低，且这种降低与抽搐运动速度无关。这表明动态和空间上不同的 PilJ 甲基化状态对维持野生型抽搐运动反转率至关重要。

研究结论

本研究揭示了铜绿假单胞菌 Pil-Chp 系统中一种新的调节 MCPs 甲基化的机制。Pil-Chp 系统的响应调节因子 PilG 和 PilH 决定了 PilK 甲基转移酶和 ChpB 甲酯酶的动态空间定位。PilG 与 ChpA 结合，将 ChpB 定位到领先极点，同时排除 PilK，使 PilK 定位到滞后极点；PilH 通过拮抗 PilG，间接影响 ChpB 和 PilK 的定位。这种空间组织对维持野生型甲基化 PilJ 水平至关重要。此外，PilJ 甲基化影响 cAMP 产生的幅度和抽搐运动反转的频率，每个极点具有不同且动态的 PilJ 甲基化状态。这一发现为理解细菌化学感应系统中 MCPs 甲基化的调节机制提供了新的视角，也为进一步研究细菌的感官适应和致病机制奠定了基础。

研究展望

尽管本研究取得了重要进展，但仍存在一些局限性。例如，研究中表达的 mNG-PilK 迁移为比预期分子量低的双峰；PilJ 预测有至少三个潜在甲基化位点，但目前尚不清楚这些位点在体外是否甲基化以及特定甲基化位点对抽搐运动或 cAMP 产生的影响；目前也没有试剂能够测试甲基化 PilJ 的空间分布。未来需要进一步研究这些问题，以更深入地理解 Pil-Chp 系统中 MCPs 甲基化的调控机制及其在细菌生理过程中的作用。