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为解决甘蓝原生质体技术中植物再生困难的问题，研究人员开展了 5 - 氮杂胞苷（AZA）和泽布拉林（ZEB）这两种 DNA 甲基转移酶（DNMT）抑制剂对甘蓝原生质体相关过程影响的研究。结果表明两种抑制剂影响原生质体发育、再生及再生植株基因组稳定性，该研究为提高植物再生效率提供新思路。
在植物研究领域，甘蓝作为世界上重要的凉季作物，其原生质体技术却因植物再生困难而受限。目前，虽然在其他植物的微孢子和体细胞胚胎发生研究中发现，诱导的表观遗传修饰可调节相关基因活动，影响最终效率，但在原生质体方面的研究却很匮乏。而且，DNA 甲基化（在胞嘧啶的 C-5 或 N-4 位置、腺嘌呤的 N-6 位置添加甲基基团的过程，它与组蛋白修饰、非编码 RNA 共同参与核基因表达和基因组稳定性的表观遗传调控）在植物生长发育和应对环境压力时起着关键作用，不过化学去甲基化对植物发育过程的影响，尤其是泽布拉林（ZEB）的作用，还未被深入探究。在这样的背景下，来自波兰克拉科夫农业大学植物生物学与生物技术系的 Agnieszka Kie?kowska 和波兰西里西亚大学自然科学学院生物学、生物技术与环境保护研究所的 Agnieszka Br?szewska 开展了相关研究，其成果发表在《BMC Plant Biology》上。
研究人员用到的主要关键技术方法有：首先，进行植物材料培养，选用两种甘蓝品种作为实验材料；其次，开展原生质体分离与培养实验；然后，设置不同实验处理组，在原生质体培养基或原生质体来源愈伤组织的再生培养基中添加 AZA 和 ZEB；最后，运用多种检测方法，如通过荧光染色评估细胞活力、细胞壁再生情况，用流式细胞术分析再生植株倍性，利用免疫染色检测 DNA 甲基化水平及分布模式等。
研究结果如下：
- AZA 和 ZEB 对原生质体衍生细胞活力的影响：在培养第一天，AZA 处理组原生质体活力随药物浓度增加而降低，ZEB 处理组在低浓度（2.5μM）时活力较高。培养第五天，AZA 处理组细胞活力低于对照组，ZEB 处理组高于对照组。这表明 AZA 和 ZEB 对原生质体衍生细胞活力的影响呈现剂量依赖性，且 ZEB 毒性低于 AZA。
- AZA 和 ZEB 对细胞壁重建的影响：通过对纤维素染色观察发现，AZA 处理组中，随着药物浓度增加，具有完全和部分再生纤维素的原生质体数量逐渐减少；ZEB 处理组中，具有再生纤维素的原生质体细胞数量整体多于 AZA 处理组。由此可见，AZA 会诱导原生质体细胞壁重建呈剂量依赖性延迟。
- AZA 和 ZEB 对有丝分裂活性的影响：在培养早期，AZA 处理组原生质体有丝分裂活性低于对照组，且随浓度增加而降低；ZEB 在低浓度（2.5μM）时可促进有丝分裂，高浓度则抑制。随着培养时间延长，对照组和处理组细胞分裂频率均增加，但 AZA 处理组低于对照组，ZEB 在 2.5μM 时处理组细胞分裂频率最高。这说明 AZA 抑制原生质体有丝分裂，ZEB 在低浓度时促进有丝分裂。
- AZA 和 ZEB 对微愈伤组织发育的影响：ZEB 处理组产生的原生质体衍生微愈伤组织数量多于 AZA 处理组，且该效果呈浓度依赖性。这表明 ZEB 能刺激原生质体衍生微愈伤组织发育。
- AZA 和 ZEB 对芽再生及再生植株倍性的影响：将药物直接应用于原生质体时，ZEB 处理组芽再生频率显著提高，AZA 处理组与对照组相似；将药物应用于原生质体衍生愈伤组织时，AZA 在一定浓度下可提高芽再生频率，ZEB 高浓度则抑制。同时，两种药物处理组再生植株中都出现了较多倍性改变的植株，AZA 处理组更为明显。这意味着 AZA 和 ZEB 对芽再生和再生植株倍性有显著影响。
- AZA 和 ZEB 对愈伤组织 DNA 甲基化的影响：两种药物处理均使原生质体衍生愈伤组织的 DNA 甲基化水平降低，且呈浓度依赖性，AZA 处理组降低更明显。免疫荧光检测发现，药物处理组与对照组的 5 - 甲基胞嘧啶（5mC）免疫信号分布模式不同。这说明 AZA 和 ZEB 诱导了低甲基化，并改变了甲基化 DNA 的分布模式。
研究结论和讨论部分指出，该研究首次比较了 AZA 和 ZEB 在植物原生质体培养不同阶段的作用及其对基因组稳定性的影响。结果显示，AZA 对原生质体毒性较大，ZEB 在促进有丝分裂和微愈伤组织发育方面表现更优。同时，药物处理时期对再生过程至关重要，添加到原生质体培养基中比直接添加到固体再生培养基中更能有效促进芽器官发生。此外，首次证实 DNMT 抑制剂可诱导植物多倍体化，这在不同胚胎发生过程中的作用有待进一步研究。该研究还表明，DNA 甲基化水平的变化部分控制了甘蓝的器官发生，过高浓度的抑制剂会抑制器官发生过程。这些发现为深入理解 DNA 甲基化在植物再生中的作用提供了重要依据，也为提高植物再生效率提供了新的策略和方向 ，对植物生物技术和作物改良领域的发展具有重要意义。
