粪肠球菌血红素降解酶RS05575的鉴定及其在适应性与致病性中的关键作用

这篇研究首次在革兰氏阳性菌粪肠球菌（E. faecalis）中发现了一种厌氧血红素降解酶RS05575（功能类似E. coli的ChuW），通过基因敲除和动物模型证明其通过降解血红素释放铁离子，显著影响细菌在宿主体内的定植能力（如胃肠道）和致病性（如心内膜炎、腹膜炎）。该酶在低氧环境下活性增强，其同源蛋白广泛存在于其他革兰氏阳性兼性厌氧菌中，为细菌适应宿主铁限制环境和毒力进化提供了新视角。

　　

ABSTRACT
粪肠球菌（Enterococcus faecalis）作为肠道共生菌和机会致病菌，其毒力与金属离子获取能力密切相关。研究发现，当缺失全部五个铁转运系统（Δ5Fe菌株）时，血红素（heme）仍能支持其生长，暗示存在未知的铁获取机制。通过生物信息学分析，在粪肠球菌OG1RF基因组中鉴定出与大肠杆菌（E. coli）厌氧胆绿素合成酶（ChuW）功能相似的基因OG1RF_RS05575（简称RS05575），其编码的酶在厌氧条件下催化血红素降解，释放铁离子和线性四吡咯产物anaerobilin。

INTRODUCTION
粪肠球菌的致病性与其抵抗宿主营养免疫（nutritional immunity）的能力相关。血红素作为人体最丰富的铁源，通常通过血红素加氧酶（HO-1）或非经典酶（如金黄色葡萄球菌IsdG/I）在需氧条件下降解。然而，粪肠球菌缺乏这些酶类，但存在与革兰阴性菌ChuW结构相似的RS05575（23%氨基酸同源性，RMSD 3.01），其保守的r-SAM基序（CXXXCXXC）和关键天冬氨酸残基提示其可能参与厌氧血红素代谢。

RESULTS
1. 血红素作为粪肠球菌的主要铁源
竞争实验显示，血红素（10 μM）抑制⁵⁵Fe摄取效率（90%）高于FeSO₄（70%）。血红素处理显著下调铁转运基因（如fitA降低15倍），但上调锰转运基因mntH2（10倍）和血红素外排泵hrtA（100倍），表明血红素可能通过铁-锰平衡调节金属稳态。

2. RS05575的结构与分布特征
AlphaFold2预测显示，RS05575与ChuW三维结构高度相似（TM-score 0.78），可能通过Y7、H250等残基结合血红素。系统发育分析表明，RS05575同源物广泛存在于肠球菌科、链球菌和葡萄球菌中，且与细菌能否合成血红素或产H₂O₂无关。

3. 厌氧条件下的功能验证
在严格厌氧环境（FMC_O2P）中，ΔRS05575菌株无法降解血红素，导致胞内血红素积累（增加73%）。Δ5FeΔRS05575六重突变体在血红素去除后3小时内降解能力丧失65%，而野生型仅降低35%。有趣的是，ΔRS05575在微需氧条件下（静态培养）即表现出血红素敏感性，提示该酶在低氧环境中起关键作用。

4. 转录调控与表达模式
与E. coli chuW受Fur调控不同，RS05575转录不受铁、血红素或氧气水平影响，呈组成型表达。小鼠腹膜炎模型和血液暴露的转录组数据也支持其表达稳定性。

5. 致病性关联
动物实验揭示：

• 腹膜炎模型：ΔRS05575在腹膜腔和肾脏的定植能力显著减弱（1-2 log），而Δ5Fe仅在腹膜腔缺陷，提示血红素利用率影响组织特异性感染。
• 心内膜炎模型：竞争性感染中，Δ5FeΔRS05575在心脏赘生物的回收率最低（<5% vs 野生型48%）。
• 肠道定植：所有突变体（尤其是六重突变体）在抗生素处理的小鼠肠道中定植能力持续下降，表明铁和血红素代谢共同调控生态位适应性。

DISCUSSION
本研究首次在革兰氏阳性菌中证实厌氧血红素降解酶（RS05575）的生物学功能，其通过r-SAM依赖的甲基转移反应线性化卟啉环，填补了兼性厌氧菌在缺氧环境中维持铁稳态的机制空白。值得注意的是，RS05575同源物在多种病原菌中的保守性暗示其可能是一类未被充分认识的毒力因子。未来研究可探索该酶在生物膜形成或炎症性肠病（如结肠炎相关血红素升高）中的作用，为抗感染策略提供新靶点。

MATERIALS AND METHODS
实验采用化学限定培养基（FMC）控制金属浓度，通过⁵⁵Fe摄取实验、RT-qPCR和血红素检测试剂盒（Sigma）量化代谢变化。基因敲除利用pCJK47接合系统完成，动物模型包括C57BL/6J小鼠腹膜炎、新西兰兔心内膜炎和万古霉素预处理肠道定植模型，均通过CFU计数和竞争性PCR分析菌株适应性。统计学处理使用GraphPad Prism 10进行ANOVA或Mann-Whitney检验。