PP1/PNUTS 磷酸酶：调控转录终止的关键分子，为基因表达研究开辟新方向

本文聚焦于转录终止机制，研究发现 PP1/PNUTS 磷酸酶通过与限制因子（ZC3H4/WDR82）结合，促进 RNA 聚合酶 II（RNA Pol II ）转录终止。这一成果揭示了转录终止的新机制，为深入理解基因表达调控提供了重要依据，值得关注。

　　

研究背景

在多细胞生物中，启动子具有双向性，会产生正义和反义转录。正义转录终止主要通过 “鱼雷” 机制，而反义转录的终止机制却并不明确，其中一种重要的非多聚腺苷酸化依赖的终止方式与限制因子（ZC3H4/WDR82 异二聚体）有关。RNA 聚合酶 II（RNA Pol II）的 C 末端结构域（CTD）的磷酸化和去磷酸化在转录周期中发挥着关键作用，但它们对转录延伸 - 终止转换的贡献尚不清晰。PP1/PNUTS 在转录终止中具有重要作用，然而其具体功能机制仍有待研究。

研究方法

1. 免疫沉淀和质谱分析：使用基于质谱的蛋白质鉴定方法，对免疫沉淀的带有表位标签的 PNUTS 进行分析，探究与之相互作用的因子。
2. 构建融合蛋白：构建 PP1 与 PNUTS 的融合蛋白，包括野生型 PP1（PP1^WT）和催化失活的 PP1（PP1^H66K），并将其在 HEK293 细胞中诱导表达，用于研究 PP1/PNUTS 在转录终止中的作用。
3. AlphaFold 建模：运用 AlphaFold2 进行建模，预测 PP1/PNUTS 与限制因子的相互作用模式及相关蛋白复合物的结构。
4. 转录分析技术：采用 Bru-seq（溴尿苷测序）、ChIP-seq（染色质免疫沉淀测序）和 eNET-seq（增强型新生延伸转录本测序）等技术，监测转录过程，分析 RNA Pol II 的磷酸化状态及转录终止情况。

研究结果

1. PNUTS 与限制因子结合：通过免疫沉淀和质谱分析发现，PNUTS 能与限制因子的两个亚基 WDR82 和 ZC3H4 共纯化，且这种结合依赖于 PNUTS 的 WDR82 结合域（WBD）。AlphaFold 建模显示，在预测的 PP1/PNUTS/WDR82/ZC3H4（PPWZ）复合物中，WDR82 可同时与 PNUTS 和 ZC3H4 接触。
2. PP1 磷酸酶促进限制因子介导的转录终止：Bru-seq 分析表明，表达 PP1^H66K-PNUTS 会显著增加反义 / 正义转录比例，且反义转录本延伸更远，这说明 PP1 的磷酸酶活性对反义转录终止具有正向调节作用。
3. PP1^H66K-PNUTS 模拟相关蛋白缺失的影响：PP1^H66K-PNUTS 的作用效果与 ZC3H4、ARS2 和 PNUTS 缺失的效果相似，都能上调反义转录，这表明 PP1^H66K-PNUTS 是限制因子介导的转录终止的有效抑制剂。
4. WDR82 结合对 PP1^H66K-PNUTS 功能的重要性：缺失 WBD 的 PP1^H66K-PNUTS^ΔWBD对限制因子功能的抑制作用显著降低，这表明 PP1^H66K-PNUTS 与 WDR82 的结合是其发挥对反义转录终止抑制作用的关键。
5. CTD Ser5 去磷酸化与转录终止的关系：ChIP-seq 结果显示，PP1^H66K-PNUTS 会导致 RNA Pol II CTD Ser5 在基因 5′端超磷酸化，且这种作用依赖于 WDR82 结合。eNET-seq 分析发现，Ser5 超磷酸化的 RNA Pol II 相对于总 RNA Pol II 的暂停现象减少，这表明 CTD Ser5 去磷酸化可能通过增加 RNA Pol II 的暂停来促进转录终止。

研究结论

1. PP1/PNUTS 与限制因子的相互作用：PP1/PNUTS 通过 PNUTS 的 WBD 与限制因子结合，形成的复合物在转录终止中发挥重要作用，这一发现修正了之前认为 WDR82 与 PNUTS 和 ZC3H4 结合相互排斥的观点。
2. CTD Ser5 去磷酸化的作用：PP1/PNUTS 可能通过去磷酸化 RNA Pol II CTD Ser5 来促进转录终止，限制因子可能作为 PP1/PNUTS 的底物适配器，引导磷酸酶作用于相关底物。
3. 转录终止机制的普遍性：研究揭示了 CTD Ser5-P 和磷酸酶在 RNA Pol II 转录终止中的重要作用，这一机制在不同生物和转录终止过程中具有一定的普遍性。

研究展望

虽然本研究取得了重要进展，但仍存在一些局限性。PPWZ 复合物的完整组成、亚基化学计量和底物特异性尚未确定，CTD Ser5 去磷酸化促进转录终止的具体机制也有待进一步研究，未来需要更多的实验来深入探索这些问题。