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本文运用基因组解析转录组学方法，研究奥胡斯湾沉积物中四氯乙烯（PCE）呼吸培养物里的有机卤化物呼吸细菌（OHRB）。成功组装 37 个高质量基因组箱，发现多个含还原脱卤酶（RDase）基因的新 OHRB，还揭示其基因调控机制，为理解全球卤素循环提供重要依据。
### 研究背景
有机卤化物呼吸细菌（OHRB）能够利用卤化化合物的还原脱卤作为终端电子接受过程获取生长能量，在有机卤化物污染场地的生物修复和自然卤素循环中发挥着关键作用。已知的 OHRB 隶属于特定的门，如
Chloroflexota、
Proteobacteria和
Firmicutes等，但关于介导自然卤素循环的新型 OHRB 的信息仍十分匮乏。
海洋环境中存在天然产生的有机卤化物，如藻类可产生四氯乙烯（PCE），研究其在地球化学碳和卤素循环中的作用及生态生理重要性意义重大。此前对海洋沉积物中 OHR 的探索主要基于培养依赖和分子检测方法，虽发现一些潜在的 OHR 相关微生物，但仍缺乏明确的生理证据，且相关 OHRB 未被分离和明确鉴定。
本研究旨在结合无沉积物的 PCE 脱氯富集培养物的宏基因组学和转录组学以及生理观察，鉴定参与 PCE 脱卤的 OHRB 及其 RDase 基因，为深入理解海洋环境中的还原脱卤过程提供依据。
材料与方法
- 化学试剂：实验所用 PCE、TCE 等化学试剂均购自 Sigma - Aldrich，乳酸和硫酸盐储备液经滤菌处理，其他化学试剂为分析级或更高等级。
- 培养方法：在无硫酸盐（NS）或添加硫酸盐（S）的海洋培养基中培养，经过多次转接和添加 PCE、乳酸、硫酸盐等物质，获得不同阶段的培养物用于后续实验。
- 分析方法：采用气相色谱 - 质谱联用仪（GC - MS）、紧凑型气相色谱（GC - PDD）、高效液相色谱（SHIMADZU LC2030 PLUS）、离子色谱（Dionex ICS - 2100）等仪器分别测定 PCE、TCE、cDCE、氢气、甲烷、有机酸、硫酸盐、硫化物等物质的含量。
- DNA 和 RNA 提取：对培养物进行离心、洗涤后，分别使用 MasterPure 革兰氏阳性 DNA 纯化试剂盒和珠磨法提取 DNA 和 RNA，并对 RNA 进行纯化和质量检测。
- 宏基因组数据分析：通过 Illumina 测序和 Oxford Nanopore 测序获得宏基因组序列数据，利用 MetaWRAP、OPERA - MS、Anvi'o 等工具对数据进行处理、组装、分箱、分类和系统发育分析。
- OHR 箱和 RDases 的系统发育分析：筛选出高质量的基因组箱（MAGs）进行系统发育分析，利用特定的 HMM 文件鉴定潜在的还原脱卤细菌箱，并构建系统发育树确定其进化位置。
- 宏转录组数据分析：对宏转录组数据进行清洗和量化，使用 Tuxedo 软件包进行基因组引导的 RNA - seq 分析，构建功能基因的表达谱。
- 不同箱中编码代谢途径的功能分析：运用 MagicLamp 搜索代谢标记基因，评估 37 个组装箱的潜在代谢功能，包括与硫代谢、卤素循环、氢代谢、甲烷代谢等相关的基因。
研究结果
- PCE 脱氯为 cDCE：在 NS 和 S 条件下，培养物均可将 PCE 还原脱氯为 cDCE。NS 条件下培养物脱氯速度更快，且电子供体乳酸的代谢产物在两种条件下有所不同，NS 条件下产生丙酸和乙酸，S 条件下仅产生乙酸。
- PCE 脱氯培养物中箱的丰度和表达：共获得 37 个高质量组装箱，分属于多个细菌和古菌门。不同条件下各箱的丰度和表达存在差异，部分箱在特定条件下无转录本检测到，而一些含 RDase 基因的箱在所有培养物中均有表达。
- 代表潜在 OHRB 的箱的系统发育位置：对含 RDase 基因的箱进行系统发育分析，发现它们与不同属的代表基因组存在亲缘关系，部分属的代表基因组也编码潜在的 OHR 功能。
- PCE 脱氯与硫酸盐还原和产甲烷同时发生的基因组调查：多个箱编码参与硫酸盐还原、呼吸 RDases、氢代谢和甲烷代谢的基因，但没有箱包含完整的硫酸盐还原基因集。氢气和甲烷在 NS 条件下产生，[Fe - Fe] - 氢酶基因在箱中更为丰富。
- 箱相关 RDases 的系统发育：Bin.26 中的大多数 RDase 基因聚类在一起，其 RDases 与其他箱的 RDases 在系统发育上关系较远，且与已知的 RDases 存在差异，但部分 RDases 与已知 RDases 有一定的序列相似性。
- PCE 脱氯过程中 RDase 基因的表达：不同 RDase 基因的表达情况各异，部分基因在特定条件下不表达，而 Bin.26 中的多个 RDase 基因在 PCE 脱氯过程中表达，暗示其在 PCE 脱卤中的重要作用。部分 RDase 基因的相邻基因多样，转录调节因子编码基因常见。
- RDase 基因侧翼的多样调控系统：与 RDases 相邻的转录调节因子编码基因多样，包括 CRP/FNR、TCS 等。不同调节因子的转录水平不同，还预测了它们的结合位点，发现一些新的调控系统，如 SigW 等，其调控机制有待进一步研究。
讨论
- 广泛分布的 RDases：本研究通过基因组解析策略发现，除了已知的 OHRB 所属门，Bacteroidota、Spirochaetota和Synergistota等门也存在含 RDase 基因的潜在 OHRB，且部分基因在 PCE 脱氯培养物中表达。Bin.26 中 RDase 基因数量远超典型 OHRB，且序列差异大，可能源于水平基因转移。Desulfobacterota门中部分菌株携带 RDase 基因，Bin.15 中的 TPh - RDase 虽未报道用于呼吸脱卤，但在本研究中显示出潜在的 PCE 降解活性。
- RDase 基因簇：部分 OHR 箱缺乏编码锚蛋白 B 的基因，暗示可能存在细胞质脱卤现象。RDase 基因常与多种功能基因相关，如伴侣基因、电子传递复合物编码基因等，有助于维持 RDase 活性和促进 OHR。转录调节因子编码基因频繁位于 RDase 基因侧翼，新发现的调控系统丰富了脱卤调控模式，为深入理解自然系统中的还原脱卤及其调控提供了新视角。
