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在细胞信号调控中，丝氨酸 / 苏氨酸磷酸化信号极为关键，蛋白磷酸酶 2A（PP2A）的 B55 亚基在底物和调节剂招募机制方面尚不明确。研究人员通过冷冻电镜（cryo-EM）和核磁共振（NMR）光谱技术研究发现了 p107 和 Eya3 与 PP2A:B55 的结合机制，为靶向该复合物的治疗提供了方向。
在细胞的微观世界里，各种生物过程的调控精细而复杂，其中丝氨酸 / 苏氨酸磷酸化依赖的信号通路就像一部精密机器的齿轮，精准地控制着大多数生物过程。蛋白激酶负责给丝氨酸和苏氨酸残基加上磷酸基团，而蛋白磷酸酶则起着相反的作用，二者共同维持着细胞内磷酸化水平的平衡。在众多蛋白磷酸酶中，蛋白磷酸酶 2A（PP2A）是一位 “重要成员”，它高度保守，在调节细胞信号传导、抑制肿瘤生长等方面发挥着关键作用，堪称细胞内的 “信号调节卫士”。
PP2A 以三聚体全酶的形式发挥作用，由催化亚基 PP2Ac、支架亚基 PP2Aa 和不同的调节亚基（如 B55、B56 等）组成。其中，B56 亚基的底物招募机制相对清晰，它能与含有 LxxIxE 短线性基序（SLiMs）的底物和调节剂结合，且结合亲和力受磷酸化和相邻动态电荷 - 电荷相互作用的调节。然而，PP2A 中最丰富的全酶 PP2A:B55，其底物和调节剂的招募机制却如同神秘的面纱，亟待揭开。此前，虽然对 PP2A:B55 与一些蛋白抑制剂的相互作用有所研究，但对于其与生理相关底物和调节剂的结合机制，仍知之甚少。
为了深入了解 PP2A:B55 的底物和调节剂招募机制，来自美国康涅狄格大学健康中心（University of Connecticut Health Center）的研究人员 Sathish K. R. Padi、Rachel J. Godek、Wolfgang Peti 和 Rebecca Page 开展了一系列研究。他们的研究成果发表在《Nature Structural & Molecular Biology》上，为该领域带来了重要突破。
研究人员主要运用了冷冻电镜（cryo-EM）和核磁共振（NMR）光谱这两种关键技术。冷冻电镜可以在接近生理状态下，以原子分辨率观察生物大分子的结构；核磁共振光谱则能从原子水平研究生物分子的动态变化和相互作用。通过这两种技术的结合，研究人员得以从多个角度深入探究 PP2A:B55 与底物和调节剂的相互作用。
映射 p107 和 Eya3 与 B55 及 PP2A:B55 的相互作用
研究人员首先利用 NMR 技术，对 p107 和 Eya3 与 B55 及 PP2A:B55 的相互作用进行了研究。他们发现，p107 通过其无序的结构域间区域（aa 594 - 783）与 B55 和 PP2A:B55 结合，其中 aa 619 - 625 是 B55 结合的关键区域。Eya3 同样能直接与 B55 结合，其结合区域为 aa 68 - 83。进一步研究表明，p107 和 Eya3 与完整的 PP2A:B55 全酶结合时，结合的残基超过 20 个，这表明它们的结合方式与那些通过短 SLiM 与 B56 亚基结合的底物和调节剂有所不同。
PP2A:B55 - p107 和 PP2A:B55 - Eya3 的冷冻电镜结构
通过冷冻电镜技术，研究人员成功解析了 PP2A:B55 - p107 和 PP2A:B55 - Eya3 复合物的结构，分辨率分别达到 2.6 ? 和 2.7 ?。结构显示，这两种复合物都呈现出与之前观察到的抑制剂结合结构中相似的收缩马蹄形构象，且该构象主要由 PP2Ac C 末端残基的甲基化状态决定。p107 以螺旋形式结合在 B55 上，其 N 末端与 B55 壁结合，C 末端朝向 PP2Ac 催化位点；Eya3 则以伸展的方式结合在 B55 上，二者结合 B55 的相同表面，但构象不同。
PP2A:B55 对 p107 的招募
深入分析 p107 与 B55 的结合机制发现，p107 的 N 末端（615SPLMHP620）通过 L617 和 H619 与 B55 壁的疏水口袋 P7 和疏水 / 极性口袋 P8 结合，在 P620 处发生弯折，形成三螺旋结构（621 - 632），延伸向 PP2Ac 催化口袋。p107 与之前研究的 PP2A:B55 特异性抑制剂 FAM122A 的结合机制相似，都利用螺旋结构与 B55 平台结合。此外，p107 能抑制 PP2Ac 对 DiFMUP 的去磷酸化作用，且 PP2A:B55 对 p107 的去磷酸化具有位点选择性，优先去磷酸化 pS640，这是因为 pS640 在结合状态下紧邻 PP2Ac 活性位点，而 pS615 距离活性位点较远。
p107 的去磷酸化
p107 是 PP2A:B55 的蛋白底物，它被多种激酶磷酸化，其中 CDK2 - 周期蛋白 A2 能使 p107 的615SP616和640SP641磷酸化。研究人员通过 NMR 光谱监测 PP2A:B55 对 p107 磷酸化位点的去磷酸化动力学，发现 pS640 能被快速去磷酸化，而 pS615 的去磷酸化则相对缓慢，这与 PP2A:B55 - p107 的结构相吻合，进一步证实了 PP2A:B55 对 p107 去磷酸化的位点选择性。
PP2A:B55 对 Eya3 的招募
Eya3 与 B55 的结合机制与 p107 不同，它缺乏 B55 特异性的短螺旋基序（SHelM），在未结合状态下也没有明显的二级结构偏好。结构显示，Eya3 以伸展的方式结合 B55，其 N 末端的 Y72、K75 和 Y77 分别与 B55 的疏水口袋 P8、P9 和 P2 结合，H79 与 B55 的酸性口袋 P4 结合，形成 π - 堆积相互作用，进一步稳定结合。Eya3 与 B55 结合的关键残基在 Eya 家族中高度保守，Eya2 的 N 末端区域（aa 40 - 84）也能直接结合并招募 PP2A:B55。
研究结论表明，PP2A:B55 的底物和调节剂通过多种策略与 B55 结合，p107 和 Eya3 虽然结合 B55 的相同表面，但构象不同。这种结合方式的多样性使得从序列预测新的 B55 底物和调节剂充满挑战。同时，PP2A:B55 对 p107 的去磷酸化具有位点选择性，确保了只有特定的磷酸化位点被优先去磷酸化，从而精确调控 p107 的活性。
该研究具有重要意义。PP2A:B55 在有丝分裂和 DNA 损伤修复等关键细胞过程中发挥着重要作用，深入了解其底物和调节剂的招募机制，为研究与疾病相关的突变提供了分子基础。研究成果为开发针对 PP2A:B55 复合物的治疗方法提供了新的思路，例如可以通过阻断特定调节剂与 B55 的相互作用来实现精准治疗。此外，研究还强调了冷冻电镜与核磁共振光谱技术结合在研究生物大分子相互作用中的重要性，为后续相关研究提供了技术参考。这一研究成果为生命科学和医学领域在细胞信号调控和疾病治疗靶点研究方面开辟了新的道路，有望推动相关领域的进一步发展。
