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为探究 BoDV-2 的病毒学特性，研究人员重新评估其全基因组序列并建立反向遗传系统。结果发现多个核苷酸替换，BoDV-2 不诱导超级感染排除。该研究有助于了解 BoDV-2 特性，为开发针对致病哺乳动物正博尔纳病毒的疫苗和药物提供依据。
在神秘的病毒世界里，Borna 病病毒如同隐藏在黑暗中的幽灵，引发了科学界的高度关注。Borna 病病毒属（Orthobornavirus）中的 Borna 病病毒 1（BoDV-1）和花松鼠博尔纳病毒 1（VSBV-1）已被证实是能导致人类致命性脑炎的人畜共患病原体 。BoDV-2 与 BoDV-1 有着高度的遗传同源性，并且被认为具有相同的地理分布，这意味着它可能也对人类健康存在潜在威胁。然而，由于 BoDV-2 的分离数量极为有限，其致病性、感染性等病毒学特性在很大程度上仍是未解之谜。这种未知犹如一层迷雾，笼罩在科研人员的心头，促使他们迫切地想要揭开 BoDV-2 的神秘面纱，深入了解它的特性，以便更好地应对可能出现的健康危机，这便是开展这项研究的重要原因。
日本京都大学（Laboratory of RNA Viruses, Department of Virus Research, Institute for Life and Medical Science, Kyoto University；Department of Molecular Virology, Graduate School of Medicine, Kyoto University；Department of Mammalian Regulatory Network, Graduate School of Biostudies, Kyoto University）和德国弗里德里希 - 勒夫勒研究所（Institute of Diagnostic Virology, Friedrich-Loeffler-Institute）的研究人员 Takehiro Kanda、Pauline Dianne Santos 等人，针对 BoDV-2 展开了深入研究。他们重新评估了 BoDV-2 的全基因组序列，建立了反向遗传系统来探究其病毒学特性。研究发现，BoDV-2 存在多个核苷酸替换，这些替换影响了病毒的聚合酶活性和生长能力，并且 BoDV-2 不会诱导细胞发生超级感染排除现象。这一研究成果发表在《npj Viruses》上 ，为我们深入了解 BoDV-2 的生物学特性提供了关键线索，对开发针对致病哺乳动物正博尔纳病毒的有效疫苗和抗病毒药物具有重要意义。
在研究过程中，研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：一是对 BoDV-2 感染的 Vero 细胞进行全基因组测序，获取准确的基因组信息；二是构建质粒，通过定点突变引入核苷酸替换，研究其对病毒蛋白表达和功能的影响；三是进行反向遗传学实验，拯救重组病毒，研究病毒的复制和生长特性；四是采用免疫荧光测定（IFA）、实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）和流式细胞术等技术，检测病毒感染情况、病毒 RNA 拷贝数以及细胞感染比例等。
下面来详细看看研究结果：
- 重新评估 BoDV-2 的完整基因组序列：研究人员通过对持续感染 Vero 细胞的总 RNA 进行鸟枪法测序，重新评估了 BoDV-2 分离株 No/98 的全基因组序列。与已公布序列相比，发现 P 基因有 1 个核苷酸差异，L 基因有 5 个核苷酸差异。其中，L 基因 2762 和 3334 位的核苷酸替换导致氨基酸改变，同时还在 L 基因和 P 基因中检测到多个单核苷酸多态性（SNPs） 。此外，通过快速扩增 cDNA 末端（RACE）分析确定了基因组和反基因组的末端序列，发现重新评估的序列在基因组 5’端缺少尿嘧啶。
- BoDV-2 L 聚合酶活性的恢复：研究人员构建了含有不同核苷酸替换的 L cDNA 表达质粒，通过蛋白质免疫印迹（western blotting）检测发现，引入特定的连接子序列后可检测到 BoDV-2 L 的表达。BoDV-2 微型复制子（minireplicon）检测显示，2762 位核苷酸替换可恢复聚合酶活性，而 3334 位替换单独存在时无此作用。反向遗传学实验成功拯救出含有 2762 位核苷酸替换的重组病毒 rBoDV-2，且同时含有 2762 和 3334 位替换的 rBoDV-2 似乎恢复效率更高，但 rBoDV-2LRG的生长能力较非重组的 BoDV-2 分离株 No/98 弱 。
- L 基因中的非同义 SNPs 促进 BoDV-2 生长：序列分析发现 L 基因的 C 末端结构域（CTD）存在两个非同义 SNPs，构建含有这些替换的 L 表达质粒进行微型复制子检测，发现不同替换对聚合酶活性影响不同。生成含有相应替换的 rBoDV-2 并评估其生长动力学，结果表明，尽管 4250 位替换在微型复制子检测中对聚合酶活性有负面影响，但含有任一 SNP 替换的 L 蛋白都显著促进了 rBoDV-2 的病毒传播和 RNA 合成 。
- P 基因中的非同义 SNP 加速 BoDV-2 生长：在 P 基因 456 位发现一个非同义 SNP，通过微型复制子检测和 rBoDV-2 变异体研究，发现该替换导致 P 基因编码的蛋白发生氨基酸改变，轻微增加了 LRG的聚合酶活性，显著促进了 rBoDV-2 的病毒传播和 RNA 合成 。
- 缺乏超级感染排除维持了 BoDV-2 持续感染细胞中的低适应性多态性：BoDV-2 分离株 No/98 在持续感染 Vero 细胞中长期传代，但一些显著减弱病毒复制能力的 SNPs 仍稳定存在。研究人员通过感染实验发现，BoDV-2 不表现出超级感染排除现象，高生长能力的病毒能超级感染低生长能力病毒感染的细胞，且低生长能力的病毒基因组在超级感染细胞中仍能维持并复制 。
综合研究结论和讨论部分，此次研究成功建立了 BoDV-2 的反向遗传系统，揭示了 BoDV-2 通过不诱导超级感染排除来维持持续感染细胞中的遗传多样性 。研究还发现，多个核苷酸替换影响了 BoDV-2 的聚合酶活性和生长能力，这些替换可能通过影响病毒蛋白与宿主或病毒蛋白之间的相互作用来发挥作用 。BoDV-2 不诱导超级感染排除的特性，可能在其持续感染的建立中起着关键作用，这一特性有助于病毒在感染细胞中维持低适应性变异体，调节病毒复制动力学和细胞病变效应 。然而，目前仍不清楚这些发现是否是 BoDV-2 特有的，还需要进一步研究来明确 。总体而言，该研究为深入了解 BoDV-2 的生物学特性提供了重要依据，对开发针对致病哺乳动物正博尔纳病毒的有效防控策略具有重要的指导意义，有望推动相关疫苗和抗病毒药物的研发进程。
