芯片上的套叠式血管生成：内皮细胞分层形成管腔血管桥的证据 —— 为血管生成机制研究与疾病治疗开辟新视野

本文利用微流控芯片技术，构建了模拟血管环境的模型（微流控芯片上的微管道，Microvessel-on-a-chip），深入探究套叠式血管生成（Intussusceptive angiogenesis，IA）过程中内皮细胞跨管腔桥形成的机制。研究发现内皮细胞可通过分层形成动态桥结构，这为理解 IA 机制及相关疾病治疗提供新思路，值得关注。

　　

研究背景

血管生成在胚胎发育、组织再生及多种疾病进程中意义重大。套叠式血管生成（IA）作为一种独特的血管生成方式，通过将已有血管纵向分裂为两个子血管来发挥作用，在发育中的肺、心肌、肝脏、肠道，以及成体骨骼肌、肿瘤、结肠炎、COVID-19 肺部疾病等多种生理和病理环境中均有重要意义。然而，目前对于 IA 过程中血管分裂和复制的机制，尤其是内皮细胞跨管腔桥的形成机制，了解十分有限。此前提出的诸如内皮细胞表面内陷、毛细血管壁折叠、纳入管外血管环、反向内皮出芽等机制，均存在解释上的不足，且由于难以对管腔内的瞬时事件进行研究，缺乏有效的体外模型，这一领域的研究进展缓慢。

实验设计

为深入探究 IA 过程中内皮细胞跨管腔桥的形成机制，研究人员运用微流控技术构建了一种封闭的、小口径（80μm 直径）的三维微通道，通道内完全由内皮细胞铺衬。通过在纤连蛋白包被的表面，采用可控的、直接可视化的细胞递送方法接种内皮细胞，并施加不同大小的壁面剪切应力（0.04 - 20 dyn/cm²），模拟体内复杂的血流环境。同时，运用共聚焦显微镜、三维重建、时间序列成像等技术，对内皮细胞的动态行为、跨管腔桥的形成和结构进行了细致观察和分析。此外，还通过对细胞骨架进行干预，如使用细胞松弛素 D、blebbistatin、Rho 激活剂 II 等试剂，以及阻断 α5β1 整合素和 αvβ3 整合素，探究其对跨管腔桥形成的影响。

实验结果

1. 构建功能性内皮微流控管道：在所有的流动条件下，内皮细胞均能在通道内形成连续的单层，且形成富含 VE - cadherin 的细胞间连接，呈现出丰富的肌动蛋白微丝束。当流体剪切应力为 10 dyn/cm²时，大多数（52 ± 3%）内皮细胞逆着血流方向极化；在 0.8 dyn/cm²时，逆着血流方向极化仍占主导（45 ± 3%）。同时，微通道的内皮导管会向内重塑，使微血管拐角变圆，形成接近圆形的管腔横截面，且在基底表面发现了 IV 型胶原蛋白和层粘连蛋白，表明内皮细胞保留了生理极性。
2. 微通道中可形成多种形态的管腔内内皮桥：在 24 个灌注固定的微通道中，共发现 268 个跨管腔内皮细胞桥，超过 90% 的通道至少含有一个桥。这些桥形态多样，可分为 3 种类型：Type 1 桥呈丝状或索状，直径约 1μm，无细胞核；Type 2 桥含有部分或全部细胞核；Type 3 桥为多细胞桥，含有多个细胞核。桥的形态受剪切应力影响，多细胞柱仅在低剪切应力（<2 dyn/cm²）条件下出现，Type 1 桥在低、高剪切应力条件下均最为常见。部分多细胞桥具有可识别的核心，包含细胞外基质（ECM）成分，与体内的管腔柱和早期分裂相似。
3. 芯片上的内皮桥与体内相似：通过对文献中体内跨管腔血管桥的组织学图像进行系统回顾，发现所有观察到的桥都可归类为与芯片上相似的 3 种类型，其中最常见的是无细胞核的细桥。在对 9 例患有肢体威胁性缺血的患者下肢皮肤样本研究中，也观察到了广泛的皮肤血管化和多种形态的跨管腔内皮桥，且桥的患病率在伤口边缘高于远端。
4. 跨管腔桥由周向定向内皮细胞的部分分层形成：通过多平面三维时间序列共聚焦显微镜观察发现，周向定向的内皮细胞可部分从管腔壁上抬起，通过伸长、部分分层的方式形成桥，且桥形成后具有动态变化，如破裂、细胞间连接重组等。
5. 桥形成依赖肌动球蛋白调节和整合素作用：破坏肌动蛋白（如使用细胞松弛素 D）或过度激活 Rho 会抑制跨管腔桥的形成，而抑制非肌肉肌球蛋白 II（NMM - II）的 ATP 酶活性（如使用 blebbistatin）则会促进桥的形成，表明桥的形成需要内皮肌动球蛋白处于功能正常但松弛的状态。阻断 α5β1 整合素可增加桥的数量并改变其形态，促进多细胞桥的形成；阻断 αvβ3 整合素则会减少桥的数量，说明这两种整合素在跨管腔桥形成过程中具有不同的作用。

讨论

1. 模型的重要意义：利用微流控芯片模型，成功模拟了早期 IA 过程，观察到内皮细胞可通过分层自主地离开管壁并穿过流动的管腔，形成与体内相似的桥结构。该模型克服了传统建模的困难，为研究 IA 机制提供了有力工具。
2. 内皮桥的结构与功能：芯片上观察到的多种内皮桥形态，反映了体内的真实情况。桥的形成过程包括周向定向细胞的伸长、局部去黏附和抬起，且桥形成后可通过招募更多内皮细胞和组织 ECM 来巩固。
3. 机制探讨：跨管腔桥的形成依赖于肌动蛋白，且需要肌动球蛋白处于可调节的松弛状态。整合素 α5β1 和 αvβ3 在桥形成过程中分别参与细胞抬起和重新定位阶段，发挥不同作用。虽然整体流体剪切应力不是桥形成的主要驱动因素，但区域剪切应力的异质性可能对桥的形成有影响。
4. 疾病关联：在肢体威胁性缺血患者的皮肤微血管中发现跨管腔内皮桥，提示 IA 在该疾病的血管生成中可能起重要作用，这也可能解释为什么促进发芽血管生成的治疗策略对该疾病无效。
5. 研究局限性：微流控血管的尺寸并非毛细血管大小，无法研究内皮细胞表面接触形成桥的机制；虽然未观察到内皮细胞突起进入并穿过流动管腔，但不能完全排除这种可能性；使用的 PDMS 基底硬度可能影响细胞行为；且目前难以在体内研究内皮细胞分层。

研究总结

本研究构建了活细胞跨管腔内皮细胞桥模型，揭示了内皮细胞可通过控制分层进入并穿过流动管腔，形成与体内相似的动态桥结构。该微生理系统不仅有助于理解 IA 的早期事件，还可作为研究非发芽血管生成的干预平台，为相关疾病的治疗提供新的理论依据和潜在的治疗靶点。