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在 western blot 分析中，常用管家蛋白作为内参的可靠性存疑。研究人员针对哮喘肺样本展开研究，发现哮喘小鼠肺部常用管家蛋白表达改变，而 Ponceau S 染色更可靠。这为哮喘研究中蛋白定量分析提供了新依据。
在生命科学研究中，蛋白质分析是探索生物机制的重要手段，而 western blot（蛋白质免疫印迹）则是常用的半定量蛋白质分析技术。在实验过程中，为了准确分析目标蛋白的表达量，需要一个可靠的参照标准，即加载对照（loading control）。通常，管家蛋白（如 β- 肌动蛋白（beta-actin）、α- 微管蛋白（alpha-tubulin）和甘油醛 - 3 - 磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH））会被用作加载对照，人们默认它们在各种实验条件下表达稳定且均一。
然而，越来越多的研究表明，这种默认并不总是成立。在不同的生理和病理状态下，管家蛋白的表达可能会发生变化。例如，在人类糖尿病患者心脏研究中，发现 β- 肌动蛋白和 GAPDH 的表达在不同心室有所差异；在人类骨骼肌研究中，也发现这两种蛋白的表达会随年龄下降。在一些临床前实验模型，如心肌梗死和缺氧缺血性脑损伤模型中，这些管家蛋白同样被证明作为加载对照并不可靠。这就意味着，如果在实验中不加验证地使用这些管家蛋白作为加载对照，很可能导致研究人员对实验结果的错误解读。
哮喘是一种常见的炎症性疾病，其特征是气道高反应性和肺部免疫细胞群的改变。在哮喘的临床前研究中，卵清蛋白诱导的实验性哮喘模型被广泛应用，因为它能模拟人类哮喘的 Th2 驱动免疫反应和气道高反应性等特征。在这个模型中，雌性小鼠比雄性小鼠表现出更强的 Th2 免疫反应，而卵巢切除后的小鼠 Th2 免疫反应会受到抑制，阉割后的雄性小鼠则对卵清蛋白诱导的气道炎症更敏感。考虑到哮喘会改变肺部免疫细胞群，常用管家蛋白在哮喘肺样本中作为加载对照的可靠性值得怀疑。但在实际研究中，很多实验室在哮喘肺样本的免疫印迹分析中并未验证加载对照的可靠性。
为了解决这一问题，来自国外研究机构的研究人员开展了一项针对哮喘小鼠肺部的研究，旨在探讨常用管家蛋白在哮喘肺样本中的表达是否一致，并寻找更可靠的加载对照方法。研究成果发表在《Biochemistry and Biophysics Reports》。
研究人员用到的主要关键技术方法有：首先建立哮喘小鼠模型，将 4 周龄 C57BL/6J 小鼠进行假手术、卵巢切除或阉割手术，之后随机分组，通过卵清蛋白致敏和激发建立哮喘模型。接着进行免疫印迹实验，提取肺组织蛋白，经 SDS-PAGE 凝胶电泳分离，转膜后用 Ponceau S 染色，再进行抗体孵育检测目标蛋白。还对支气管肺泡灌洗（BAL）液进行处理，进行白细胞计数和分类分析。
研究结果如下：
- 确定合适样本上样量：通过对不同蛋白上样量（1、3、10 和 30 μg）进行凝胶电泳和免疫印迹分析，发现 Ponceau S 染色数据与蛋白上样量在雄性和雌性小鼠正常肺组织中相关性很强。同时，alpha-tubulin、GAPDH 和 beta-actin 与蛋白上样量也有较强相关性，但综合考虑，后续实验选择 20 μg 的样本上样量，以兼顾条带可见性和线性关系。
- Ponceau S 染色与常用管家蛋白表达情况对比：对哮喘肺样本进行 western blot 分析，Ponceau S 染色结果显示，对照组和哮喘实验组之间蛋白转移到膜上的情况一致。然而，常用管家蛋白的表达却出现了变化。与雌性对照组相比，雌性假手术哮喘组和卵巢切除哮喘组的 alpha-tubulin 表达分别升高了 77.9±21.6% 和 66.1±16.7%；GAPDH 表达分别升高了 78.1±26.5% 和 68.1±13.0%；beta-actin 表达分别升高了 257±37.4% 和 278±69.2%。在雄性小鼠中，虽然部分哮喘组管家蛋白表达有升高趋势，但未达到统计学意义。
- 哮喘对肺部白细胞群体的影响：分析 BAL 液中的白细胞计数发现，雌性假手术组和卵巢切除假手术组白细胞数量显著高于各自对照组。进一步分析发现，哮喘组出现典型的哮喘特异性病理变化，雄性和雌性哮喘组的嗜酸性粒细胞比例均显著高于各自的假手术对照组。
研究结论和讨论部分指出，该研究首次系统地证明了实验性哮喘会改变哮喘小鼠肺部 alpha-tubulin、GAPDH 和 beta-actin 的表达，而 Ponceau S 染色显示总蛋白染色未发生改变。这表明 Ponceau S 染色可能是哮喘肺样本 western blot 分析中更可靠的加载对照方法，它具有价格低廉、能快速确认上样量是否一致、染色可逆且不影响后续实验结果等优点。此外，研究还发现雌性哮喘动物的管家蛋白表达增加幅度和嗜酸性粒细胞增多程度似乎比雄性更明显，推测雌性性激素可能对此有影响，但这还需要进一步研究证实。该研究为哮喘研究中的蛋白质分析提供了重要参考，提醒研究人员在选择加载对照时要谨慎，确保实验数据的准确性和可靠性，为后续哮喘机制研究和相关药物研发等奠定了更坚实的基础。
