19F NMR 助力氨基酸衍生配体研究 TSPO：开启精准诊疗新视野

为探究 TSPO 配体相互作用机制，研究人员合成19F 标记的苯丙氨酸衍生配体，用19F NMR 研究其与 mTSPO 的作用。结果发现不同环境下配体与 mTSPO 结合特性不同，为 TSPO 相关研究及诊疗提供依据。

　　在生命科学和健康医学领域，转运蛋白（Translocator protein，TSPO）是一个备受关注的研究对象。TSPO 曾被称为外周型苯二氮卓受体，它是一种在进化上高度保守的膜蛋白，广泛参与多种生理过程，在病理生理条件下也发挥着重要作用 。目前，虽然已知内源性 TSPO 配体是一种 9kDa 的多肽，并且也有研究合成出具有生物活性的二肽，但 TSPO 与这些配体形成的复合物原子结构仍未可知，其作用机制也如同迷雾一般。

TSPO 的过表达与多种炎症或恶性肿瘤相关疾病密切相关，这使得 TSPO 特异性配体成为极具潜力的诊断和治疗药物。在正电子发射断层扫描（Positron Emission Tomography，PET）成像中，不同类型的 TSPO 配体不断被开发出来，像¹¹C 和¹⁸F 标记的非苯二氮卓类衍生物（PK 11195 和 PK 14105）已在 PET 扫描成像早期发展中得到应用。¹⁸F 标记的示踪剂因其较长的半衰期（t_1/2 = 109.8 min （¹⁸F） vs 20.3 min （¹¹C）），在临床应用上具有独特优势。此外，¹⁹F 标记的分子在多模态¹H/¹⁹F 磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging，MRI）以及与其他成像技术结合方面展现出良好前景，而且体内微弱的内源性¹⁹F 信号也有利于提高¹⁹F MRI 的灵敏度和准确性。

在这样的研究背景下，为了深入了解 TSPO 与配体的相互作用机制，来自 CNRS、Université de Reims Champagne-Ardenne、Université de Strasbourg 和 Sorbonne Université 的研究人员开展了相关研究。他们合成了一种新的氨基酸衍生氟化配体，并通过¹⁹F NMR 光谱技术对其与小鼠转运蛋白（mTSPO）的结合特性进行研究。该研究成果发表在《Biochimie》杂志上，为 TSPO 相关研究及临床应用提供了重要依据。

研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先是化学合成技术，通过多步反应合成目标配体 NCS7083 和 RF3458；其次是 NMR 实验技术，利用¹H、¹³C 和¹⁹F NMR 光谱在不同条件下对配体进行表征，并研究其与 mTSPO 的相互作用；此外，还涉及蛋白质纯化技术，从大肠杆菌中表达并纯化重组 mTSPO。

下面详细介绍研究结果：

• 氟化化合物的合成：研究人员以已知的 TSPO 高亲和力配体 NCS7083 为基础，用 4 - 氟 - L - 苯丙氨酸替代苯丙氨酸，通过三步反应成功合成了 NCS7083 和 RF3458 两种化合物。
• 氟化化合物的表征：在 NMR 实验中，针对不同的实验环境选择合适的内标，如在磷酸盐缓冲液中用三氟乙醇（TFE）作为¹⁹F 的内标，用 3-(三甲基硅基) 丙酸钠（TSP）作为¹H 的内标。¹⁹F 光谱显示 RF3458 存在两种构象，比例约为 90:10，¹H 光谱也呈现出相似比例的两个 N-CH₃信号。研究还发现，在有机溶剂中 RF3458 只有一个¹⁹F 峰，而在用于稳定 mTSPO 的水性介质中则出现两个峰，且膜蛋白环境只影响其中一种构象。
• mTSPO 与氟化化合物的相互作用：在不同的膜模拟环境下研究 mTSPO 与 RF3458 的相互作用。在 0.2% 十二烷基硫酸钠（SDS）中，添加 mTSPO 会引起 RF3458 浓度依赖性化学位移变化；在 0.2% 二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（DPC）中，同样观察到浓度依赖性化学位移变化，据此估算出结合常数为 5.1 ± 1 μM，且两种构象在与 mTSPO 结合时表现出不同的化学位移变化。通过与高亲和力药物配体 (R)-PK 11195 的竞争实验，表明 RF3458 与 (R)-PK 11195 可能结合在 mTSPO 的同一腔体内。当 DPC 浓度增加到 1% 时，配体与 mTSPO 的亲和力发生变化，结合常数变为 25 ± 3 μM ，可能是由于配体被捕获在洗涤剂胶束中，降低了其与蛋白质的可及性。在 DMPC/DPC 混合环境中，mTSPO 与配体的结合呈现出不同的特征，从游离态到结合态的转变表现为从一个窄峰迁移到另一个窄峰，中间态出现宽峰，表明自由态和结合态之间的交换速率较慢，估算结合常数为 25 ± 5 μM ，且与之前在纯 DPC 环境中的研究相比，配体与 mTSPO 的亲和力有所降低。

研究结论和讨论部分指出，新合成的氨基酸衍生氟化配体为研究 mTSPO 在不同洗涤剂环境中的亲和力提供了有力工具。mTSPO 在不同环境下的折叠状态和配体结合能力不同，在 DPC 中其折叠状态更有利于配体结合，而在混合脂质 - 洗涤剂环境中，配体与 mTSPO 的结合表现出不同的动力学特征。通过竞争实验证实 (R)-PK 11195 能够取代¹⁹F-RF3458，说明它们可能结合在同一腔体内，但仍需进一步研究确定具体参与结合的氨基酸。此外，研究中发现的两种配体构象，其中第二种构象由于信号强度低、化学位移变化小等原因，难以准确估算其亲和力。

这项研究的重要意义在于，它为 TSPO 配体的研究提供了新的视角和方法，¹⁹F NMR 技术在研究蛋白质 - 配体相互作用方面展现出独特优势，有助于深入了解 TSPO 的作用机制。同时，研究结果也为开发新型 TSPO 配体，尤其是基于¹⁸F 的 PET 成像配体提供了理论基础。不过，要将相关研究成果转化为临床应用，还需要进行毒理学研究、确定细胞靶点以及评估细胞可及性等工作，特别是对于这种含有三个苯环的疏水性配体，如果要用于脑部疾病诊疗，还需考虑其能否穿过血脑屏障。