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在真菌研究领域，粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）细胞壁多糖合成机制尚不明确。为探究此，研究人员聚焦其 GH72 家族酶。结果发现 GEL-1 是 β-1,3 - 葡聚糖水解酶和转移酶，GEL-2 能水解多种多糖并交联。这为理解真菌细胞壁构建提供关键依据。
在微观的真菌世界里，细胞壁就像是一座坚固的城堡，守护着真菌细胞。对于真菌来说，细胞壁不仅维持细胞形态，还在生长、发育以及与外界环境的交互中发挥着至关重要的作用。粗糙脉孢菌（
Neurospora crassa）作为一种模式真菌，其细胞壁主要由几丁质、β-1,3 - 葡聚糖（层状葡聚糖，laminarin）和 β-1,3?/β-1,4 - 混合葡聚糖（地衣多糖，lichenin）等多糖构成。然而，这些多糖是如何精准地组装并交联成坚固的细胞壁结构，一直是困扰科学家们的谜题。
为了解开这个谜团，来自未知研究机构的研究人员开展了一项针对粗糙脉孢菌 GH72 家族酶的深入研究。该研究成果发表在《The Cell Surface》上，为我们揭示了真菌细胞壁构建的重要机制。
研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：一是蛋白质表达与纯化技术，通过在大肠杆菌（E. coli）和粗糙脉孢菌中分别表达带有标签的 GEL-1 和 GEL-2 蛋白，并进行纯化；二是采用薄层层析（TLC）和聚丙烯酰胺碳水化合物凝胶电泳（PACE）技术，以此来检测酶的水解酶活性和转移酶活性；三是利用蛋白质免疫印迹（western blot）技术，检测酶与多糖形成的中间体，从而确定酶的功能。
3.1 GH72 酶对营养生长至关重要
研究人员发现，在粗糙脉孢菌编码的 5 种 GH72 酶中，有 3 种在营养菌丝中表达。当缺失这 3 种酶的突变体培养时，其生长速度明显放缓，呈现出紧密的菌落形态。野生型菌株在接种后 24 小时内就能在培养皿中迅速生长，并在 2 天内产生大量分生孢子；而突变体在 2 天后几乎没有越过接种点生长，且菌丝无法在培养基上延伸。这表明 GH72 酶对于粗糙脉孢菌的营养生长起着不可或缺的作用。
3.2 GEL-1 作为 β-1,3 - 葡聚糖酶和 β- 葡聚糖基转移酶的特性
为了深入了解 GEL-1 的酶活性，研究人员先在大肠杆菌中表达 GEL-1，但所得的麦芽糖结合蛋白 MBP:GEL-1 嵌合蛋白存在于包涵体中，难以溶解。于是，研究人员转而在粗糙脉孢菌中表达带有 HIS6 标签的 GEL-1，并成功纯化。经检测，纯化的 GEL-1 能水解 β-1,3 - 葡聚糖，如从层状四糖、层状五糖、层状六糖以及层状葡聚糖中释放出较小的寡糖，却无法水解地衣多糖。同时，通过 TLC 分析发现，GEL-1 能以 β-1,3 - 葡聚糖为供体和受体多糖，形成更大的 β-1,3 - 葡聚糖，证明其具有转移酶活性。时间进程实验还表明，GEL-1 的水解酶活性在 2 小时即可显现，转移酶活性在 8 小时后能被检测到。
3.3 GEL-2 作为层状葡聚糖酶 / 地衣多糖酶和层状葡聚糖 / 地衣多糖转移酶的特性
研究人员在大肠杆菌中表达并纯化了 MBP:GEL-2 融合蛋白。TLC 分析显示，GEL-2 不仅能水解层状五糖、层状六糖和层状葡聚糖，还能水解地衣多糖，释放出较小的寡糖，这是 GEL-1 所不具备的能力。此外，GEL-2 与层状五糖和层状六糖孵育时，能产生更大的寡糖，证明其具有转移酶活性。通过 western blot 实验，研究人员还发现 GEL-2 能与地衣多糖和层状葡聚糖形成酶 - 底物中间体，这表明 GEL-2 可以将 β-1,3 - 葡聚糖和地衣多糖交联到真菌细胞壁多糖基质中。
研究结论和讨论部分指出，GH72 家族酶在真菌细胞壁生物合成中意义重大。在不同真菌的生命周期中，这些酶以冗余或部分冗余的方式表达，参与细胞壁多糖的交联，构建起细胞壁的基质结构。例如在酿酒酵母（S. cerevisiae）、白色念珠菌（C. albicans）和烟曲霉（A. fumigatus）中，GH72 酶都对细胞壁的形成起着关键作用。研究人员之前提出的 GH72 酶可能将细胞壁多糖交联到 N - 连接的半乳甘露聚糖上的模型，在此次研究中未得到验证，新的数据表明这些酶并不以糖蛋白为转移酶活性的受体。此次研究还发现，粗糙脉孢菌中属于亚家族 2 的 GEL-2 酶具有更宽松的底物特异性，能够交联地衣多糖，这对于理解地衣多糖如何融入细胞壁具有重要意义。研究人员推测，亚家族 2 的葡聚糖基转移酶可能还参与其他类型多糖融入细胞壁基质的过程，这为后续的研究指明了方向。总之，该研究深入剖析了粗糙脉孢菌 GH72 家族酶的功能，为真菌细胞壁生物合成的研究开辟了新的视野，有助于我们进一步理解真菌的生长发育机制，也为开发抗真菌药物提供了潜在的靶点和理论依据。
