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为揭示竹节参（Panax japonicus）果实颜色变化现象，研究人员分析其与色素、次生代谢物含量及合成基因的关联。结果发现果实成熟时叶绿素降解，多种物质合成增加。该研究揭示了其颜色变化机制，为相关研究提供参考。
在植物的奇妙世界里，果实的颜色不仅是一道亮丽的风景线，还蕴含着许多奥秘。果实颜色作为果实成熟的重要信号，在生态系统中扮演着关键角色。众多学者研究发现，叶绿素、类胡萝卜素、黄酮类、花青素等是影响果实颜色的主要生理指标 ，并且通过转录组分析，在多种植物中鉴定出了参与果实着色的关键酶基因。然而，对于我国二级保护野生药用植物竹节参（Panax japonicus）来说，其果实颜色在成熟过程中从绿色变为红色，再变为紫黑色，这种独特的颜色变化机制却一直是个谜。
竹节参是多年生草本植物，具有重要的药用价值，但其特殊的生长环境限制了分布范围。为了揭开竹节参果实颜色变化的神秘面纱，探索其背后的分子机制，贵州师范大学生命科学学院和安顺学院贵州省山地特色高效农业创新中心的研究人员开展了深入研究。他们的研究成果发表在《Scientific Reports》上，为进一步了解竹节参果实发育以及人参属植物果实颜色变化关键基因的探索提供了重要参考。
研究人员采用了多种关键技术方法来开展此项研究。首先，采集不同颜色变化时期的竹节参果实样本。接着，运用酶标检测法测定果实中叶绿素、类胡萝卜素、花青素、黄酮类和总酚的含量变化。然后，利用高通量测序技术对果实转录组进行测序，获得大量数据后进行拼接、聚类和功能注释。同时，通过差异基因表达分析（DEG）筛选与果实颜色变化相关的基因，运用加权基因共表达网络分析（WGCNA）挖掘关键基因模块，还进行了 GO 和 KEGG 通路富集分析。最后，使用实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）对关键候选基因进行验证。
竹节参果实色素和生理指标含量
研究人员通过酶标检测法，测定了竹节参果实五个不同颜色变化时期果皮中叶绿素、类胡萝卜素、花青素、黄酮类和总酚的动态变化。结果显示，叶绿素含量在果实从 G 期到 P 期的过程中呈下降趋势，G 期含量最高，P 期最低；类胡萝卜素含量则逐渐上升，P 期达到最高。花青素、黄酮类和总酚含量也均逐渐增加，在果实成熟的 P 期达到最高值 。这表明在竹节参果实成熟过程中，叶绿素逐渐被破坏，类胡萝卜素开始出现，花青素、黄酮类和总酚的合成对果实颜色变化起决定性作用。
测序数据质量控制和转录本拼接聚类
在 Illumina 平台对 15 个竹节参果实颜色性状变异样本进行测序，获得了 93.94 Gbp 的转录组数据。数据的 Q30 值均大于 99%，GC 含量大于 42%，序列错误率小于 0.1%，表明测序质量合格。通过 Trinity 软件拼接 clean reads，并使用 Corset 层次聚类得到最长的 Cluster 序列进行分析。结果显示，转录本和单基因序列长度大多在 200 - 400 bp，其次是 400 - 600 bp，2Kbp 以上的数量较少。
已鉴定转录本的功能注释
对 462,117 个单基因进行注释，NR 数据库注释的基因最多，占总数的 51.91%；GO 数据库注释的最少，占 25.12%。通过五个数据库的注释信息绘制维恩图，发现有 133,297 个单基因序列在五个数据库中共同注释。对 Nr 同源物种分布注释分析发现，竹节参果实基因序列与胡萝卜（Daucus carota subsp. sativus ）、中华猕猴桃（Actinidia chinensis var. chinensis）等植物的基因功能有一定关联。同时，对 GO 功能富集分类和 KEGG 代谢通路注释，发现参与代谢类别的基因比例最高，其中次生代谢物生物合成占 5.04%。此外，预测出 10,139 个编码转录因子（TFs）的转录本，分属于 93 个不同的 TF 家族，其中 MYB - related、AP2/ERF - ERF 等家族较为丰富。
差异基因表达分析
为了鉴定参与竹节参果实颜色性状变异的基因，进行了转录组差异基因表达分析。结果显示，五个时期相互比较产生的差异表达基因（DEGs）总数为 17,895 个，其中 G 组与 B 组比较的 DEGs 数量最多。进一步筛选不同颜色变化时期的 DEGs 并绘制维恩图，发现以 G 期为对照时，Y、R、B、P 期有 129 个共享差异基因，这些基因可作为下一步研究果实颜色性状变化的候选基因池。
差异基因（DETs）的 WGCNA 分析
基于基因表达相关性构建聚类树并划分模块，发现 MElightcyan 模块与 G 期和叶绿素性状显著相关，MEblack 模块与 P 期、类胡萝卜素、花青素和黄酮类性状显著相关。对 MEblack 模块的 448 个相关序列进行 KEGG 通路分析，发现其在次生代谢物生物合成和萜类、聚酮类代谢等通路富集。
差异基因的 GO 富集分析
对竹节参果实颜色性状变化过程中获得的 17,895 个 DETs 进行 GO 富集直方图分析，发现不同比较组中，DETs 在黄酮类代谢过程的生物过程中富集的基因数量最多。通过韦恩图分析各亚组中富集的黄酮类代谢过程的 DETs，发现四个亚组中有五个共同的 DETs，另外三个亚组（除 G 组与 P 组比较的亚组外）有九个共同的 DETs。这些基因在果实成熟时表达量显著增加，初步预测为竹节参果实颜色性状变异的候选基因。
KEGG 通路富集分析
对 17,895 个 DETs 进行 KEGG 通路富集气泡图分析，发现不同比较组中富集的代谢通路有所不同。黄酮类生物合成通路在 G 组与 Y 组、G 组与 R 组、G 组与 B 组比较的亚组中均有富集，而叶绿素降解相关的光合作用 - 天线蛋白通路仅在 G 组与 Y 组、G 组与 R 组比较的亚组中富集。
光合作用 - 天线蛋白候选基因及 qRT - PCR 验证
通过 KEGG 富集的光合作用 - 天线蛋白代谢通路筛选出果实叶绿素降解的差异候选基因，对富集的 30 个基因进行整理和分析，选取表达量较高的前 10 个基因进行热图聚类分析。结果显示，前七个基因在绿色果实阶段（G）表达量最高，随着果实颜色变化逐渐降低；后三个基因在 G 期不表达，在（Y、R、B）期表达，到果实成熟阶段（P）又不表达。通过 qRT - PCR 对其中六个高表达候选基因进行验证，结果与转录组数据高度一致，这些基因与叶绿素 a/b 结合蛋白（CAB）高度相似，分别命名为 PjCABI、PjCABII、PjCABIII、PjCAB1、PjCAB2和 PjCAB3。
黄酮类生物合成候选基因及 qRT - PCR 验证
利用 KEGG 富集的黄酮类生物合成通路筛选与竹节参果实颜色性状变化相关的候选基因，通过分析不同比较组得到 290 个黄酮类生物合成基因，经韦恩图分析得到 81 个与果实颜色性状变化相关的共同候选基因。对这些基因在果实颜色变化五个阶段的差异进行分析，选取五个通路中高表达的前 6 个候选基因进行热图聚类分析，并通过 NCBI 数据库比对获得基因信息，命名为 PjF3’H、PjCHI、PjCHS、PjDFR、PjANS 和 PjC3’H。随机选取九个黄酮类生物合成相关候选基因进行 qRT - PCR 验证，结果与 RNA - Seq 数据高度一致，其中 PjDFR 基因在九个候选基因中表达量最高。
在结论和讨论部分，研究表明竹节参果实颜色性状变化在生理生化方面，叶绿素含量与类胡萝卜素、花青素、黄酮类和总酚的动态变化趋势相反。转录组分析获得了 19 个与叶绿素降解相关的光合作用 - 天线蛋白通路候选基因，其中 6 个高表达关键候选基因经 qRT - PCR 验证；还获得了 81 个黄酮类生物合成代谢通路候选基因，9 个高表达关键候选基因也经 qRT - PCR 验证。该研究揭示了竹节参果实颜色性状变化的机制，即叶绿素降解与类胡萝卜素、花青素和黄酮类的合成同步进行，为深入研究人参属植物果实颜色变化的分子调控机制提供了重要依据，也为竹节参的保护和利用奠定了理论基础。
