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本文聚焦悬铃木 SUP 同源基因 PaSUP1/2/3。研究发现，它们时空表达模式不同，功能存在分化。PaSUP1 在雌花发育中作用关键，转基因拟南芥和烟草表现出花器官缺陷。这为理解植物花发育机制及解决悬铃木花粉过敏问题提供重要依据。
引言
悬铃木（Platanus × acerifolia）作为一种常见的行道树，由美国梧桐（P. occidentalis）和东方梧桐（P. orientalis）杂交而来，具有生长迅速、遮荫效果好和适应性强等优点。然而，其大量的花粉和种子毛会引发人类花粉过敏和季节性哮喘等问题。
拟南芥（Arabidopsis thaliana）中的 SUP（SUPERMAN）基因编码一种转录因子，在花器官发育中至关重要，尤其是在雄蕊和雌蕊的界限形成方面。研究悬铃木中 SUP 同源基因，有助于深入了解其花发育机制，也有望解决其实际应用中带来的问题。
SUP 基因 1991 年在拟南芥中首次被发现，最初命名为 Flo10。它编码的转录因子包含一个 N 端的 C2H2 型锌指结构域和一个 C 端的 EAR 样抑制结构域。SUP 基因的隐性突变体 sup 表现出花器官异常，第四轮雌蕊被雄蕊或雄蕊 - 雌蕊中间器官替代，这表明 SUP 在花器官发育中起着关键作用。同时，SUP 基因的表达调控较为复杂，涉及多个阶段和多种基因的参与 。
在其他物种中，SUP 同源基因也具有相对保守的功能。例如，矮牵牛（Petunia × hybrid）的 PhSUP1、黄瓜（Cucumis sativus）的 CsSUP、苹果（Malus × domestica）的 MdSUP11 等，它们在花器官发育、植株形态等方面都发挥着重要作用。本文主要研究悬铃木中的三个 SUP 同源基因 PaSUP1、PaSUP2 和 PaSUP3，探讨它们的功能分化及潜在机制。
材料和方法
实验选用华中农业大学校园内成年悬铃木 WT2 作为材料，收集不同组织用于基因表达分析。拟南芥‘Columbia’和用于转基因的烟草在实验室特定条件下培养。
根据悬铃木转录组和基因组数据设计引物，克隆 PaSUP1/2/3、PaCLF/PaTFL2 的全长序列以及 PI（PISTILLATA）基因的启动子，扩增产物连接到 pMD18 - T 载体测序。
将 PaSUP1 编码序列（不含终止密码子）与 YFP 报告基因融合，PaSUP2/3 编码序列与 EGFP 报告基因融合，构建融合质粒转化农杆菌 GV3101（pSoup 和 p19），注射到本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶表皮细胞，通过激光共聚焦显微镜观察荧光确定亚细胞定位。
提取悬铃木、拟南芥和烟草的 RNA，反转录为 cDNA 后进行定量实时 PCR（qRT - PCR），以 PaTPI、ACT2 和 NtEF1α 为内参，采用2?ΔΔCT方法计算基因相对表达量。
将 PaSUP1 编码序列构建到 pRI101 载体，PaSUP2/3 编码序列构建到 pBI121 载体，转化农杆菌后采用浸花法转化拟南芥，通过叶盘转化法转化烟草，在含卡那霉素和头孢菌素的培养基上筛选转基因植株。
收集野生型和 35S::PaSUP1 - L2 T2 转基因拟南芥花序，提取 RNA 进行下一代测序，对测序数据进行生物信息学分析，筛选差异表达基因，并进行 GO 和 KEGG 富集分析。
将 CLF/TFL2/PaCLF/PaTFL2、PaSUP1/2/3 的全长编码序列及 CLF、PaCLF 的截断序列克隆到酵母双杂交载体，转化 Y2HGold 菌株进行酵母双杂交实验。构建融合荧光蛋白的载体，转化农杆菌后共浸润本氏烟草叶表皮细胞，进行双分子荧光互补（BiFC）分析，观察荧光验证蛋白相互作用。
结果
通过最大似然法构建系统发育树，结果显示 PaSUP1 与 PaSUP2/3 差异显著，PaSUP2 和 PaSUP3 亲缘关系更近。PaSUP1 与莲（Nelumbo nucifera）的同源基因关系最近。PaSUP1 有一个 666bp 的外显子，编码 221 个氨基酸的蛋白且无内含子；PaSUP2 和 PaSUP3 外显子分别为 540bp 和 537bp，编码 179 和 178 个氨基酸的蛋白，也无内含子。三者都有与 SUP 相似的两个保守结构域，PaSUP1 的两个保守结构域与 SUP 完全相同，PaSUP2/3 在两个基序上存在单核苷酸多态性（SNPs）。
对悬铃木不同组织进行 qRT - PCR 分析，发现 PaSUP1 在雌花序中表达量最高，是幼叶的 36 倍，在顶芽和幼叶中也有较高表达，而 PaSUP3 在各组织中几乎不表达。研究 PaSUP1 在花芽中的年度相对表达节律发现，其高表达期集中在 7 月初至 9 月中旬，与单性花中雄蕊或雌蕊开始分化的时间吻合，暗示其参与单性花分化过程。PaSUP2 在 7 月中旬至 9 月中旬也有相对较高表达，可能与 PaSUP1 在单性花分化中功能冗余，而 PaSUP3 全年相对表达难以检测，功能不明确。
亚细胞定位结果表明，PaSUP1/2/3 不仅定位于细胞核，细胞核外也有荧光，说明它们可能具有复杂的功能。
将 35S::PaSUP1、35S::PaSUP2 和 35S::PaSUP3 重组质粒转化拟南芥，35S::PaSUP1 转基因拟南芥出现花器官缺陷和不育，花器官变小，外三轮抑制比第四轮更强。35S::PaSUP2/3 转基因拟南芥花器官正常，但部分植株莲座叶变小变厚。将 35S::PaSUP1 转化烟草，转基因烟草出现卷叶表型，花序变小，花器官发育受抑制，且外三轮比第四轮抑制更深，表明 PaSUP1 功能在拟南芥和烟草中高度保守。
扫描电镜观察发现，35S::PaSUP1 - L2 T2 转基因拟南芥花序变小，毛状体增多，花器官表皮细胞变小，花瓣表皮细胞形态改变，可能与 PaSUP1 抑制 B 功能基因有关。而转基因叶片表皮细胞变大，可能是由于抑制细胞分裂导致细胞数量减少，叶片变小。
转录组分析显示，35S::PaSUP1 - L2 T2 转基因拟南芥花序中，下调基因主要与花药和花粉发育调控有关。qRT - PCR 验证了部分基因的表达变化，如与植物器官衰老相关的 EFE 和 PCR1 表达上调，与花药形成、花粉成熟等相关的多个基因表达下调。
酵母双杂交和 BiFC 分析表明，PaSUP1 与 TFL2（TERMINAL FLOWER 2）存在相互作用，这可能导致 35S::PaSUP1 转基因拟南芥花序中生长素相关基因 YUC1/4（YUCCA1/4）表达下调。但目前没有证据表明 PaSUP1 与悬铃木中 TFL2 的同源基因 PaTFL2 存在相互作用，说明悬铃木中可能存在其他调控途径。
用 PI 启动子替换 35S 启动子驱动 PaSUP1 表达，pPI::PaSUP1 转基因拟南芥营养生长正常，但花器官败育不能结果，表明在花器官中特异性表达 PaSUP1 可导致不育，且不影响营养生长。
讨论
拟南芥属于核心真双子叶植物，悬铃木属属于基部真双子叶植物，二者花器官特征差异显著。拟南芥 SUP 基因参与两性花器官发育，而悬铃木为单性花，其 SUP 同源基因如何参与花器官发育值得探究。
悬铃木中三个 SUP 同源基因 PaSUP1/2/3 可能存在功能分化。PaSUP1 氨基酸序列与拟南芥 SUP 最相似，保守结构域相同，而 PaSUP2/3 的保守结构域氨基酸序列有变化。它们的时空表达模式差异明显，PaSUP1 表达最活跃，可能是主要功能基因，且其表达模式暗示其在维持雌蕊形成和单性花雌性特征发育中具有保守作用。
35S::PaSUP1 转基因拟南芥难以获得，且转基因植株各器官发育受抑制，花器官缺陷明显，而 PaSUP2/3 过表达无此现象，说明 PaSUP1 可能与花器官特异性表达基因相互作用。同时，转基因花中外三轮比第四轮受抑制更强，可能与不同组织对激素水平耐受性差异以及 PaSUP1 与外三轮特异性基因相互作用有关。
PaSUP1 与 TFL2 相互作用可能导致 YUC1/4 表达下调，这可能是转基因拟南芥花器官缺陷的原因之一。但悬铃木中可能存在其他调控途径，需进一步研究 PaSUP1 与差异表达基因的相互作用，为 SUP 同源基因调控途径提供新视角。此外，对悬铃木进行 PaSUP1 转基因改造，有望解决其花粉过敏等实际问题。
