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这篇研究聚焦 HIV-1 辅助蛋白 Nef，发现其通过招募 Src 激酶磷酸化宿主蛋白 Naf1，激活 PI3K/AKT/mTOCR1/CDK9 通路，促进前病毒 DNA 转录。该成果揭示了新机制，为攻克 HIV 感染相关难题提供关键线索。
HIV-1 Nef 蛋白：功能多样的致病 “帮凶”
HIV-1 辅助蛋白 Nef 是 HIV 致病的关键因素。它就像一个狡猾的 “破坏者”，能巧妙操控细胞内各种机制，为病毒复制、免疫逃逸和传播创造有利条件。Nef 可以下调细胞表面多种蛋白的表达，像 CD4、CD28、MHC-1 等，还能抑制免疫球蛋白类别转换，干扰 T 细胞激活。它自身虽没有催化活性，却能招募多种宿主蛋白，激活细胞信号级联反应，其中与 Src 家族激酶（SFKs）的相互作用尤为重要。
Nef 激活 HIV-1 前病毒转录：依赖 SFKs 与关键通路
研究发现，Nef 能够增强 HIV-1 的复制能力。在 CD4+ T 细胞实验中，含有 Nef 的病毒感染细胞后，gag mRNA 的产量显著增加，同时 Nef 还能促进 Tat 诱导的 LTR 活性。进一步研究发现，Nef 在激活整合前病毒 DNA 转录中也发挥着重要作用。利用 HIV-1 潜伏感染的 Jurkat T 细胞克隆（C11）进行实验，结果显示 Nef 的表达会增加 GFP+细胞数量，提高 gag mRNA 的产量。
Nef 发挥这一功能依赖于与 SFKs 的结合。研究人员构建了 Nef 突变体 Nef/AXXA，该突变体由于脯氨酸突变为丙氨酸，无法与 SFKs 结合，结果它丧失了激活 HIV-1 前病毒 DNA 转录的能力。这表明，Nef 与 SFKs 的关联对其激活前病毒转录至关重要。
那么 Nef 激活前病毒转录的下游细胞通路是什么呢？研究发现，Nef 能够激活 PI3K/AKT/mTORC1 通路。在 C11 细胞中过表达 Nef，会使 PI3K p85 亚基、AKT、mTORC1（p-mTOR-2448）以及下游蛋白 P70S6K 和 S6 的磷酸化水平呈剂量依赖性增加。而 Nef/AXXA 突变体则无法激活该通路，这再次证明 Nef 激活 PI3K/AKT/mTORC1 通路依赖于招募 SFKs。此外，mTORC1 介导的通路可诱导细胞周期蛋白依赖性激酶 9（CDK9）磷酸化，进而激活 HIV-1 前病毒 DNA 转录。研究证实，Nef 过表达会增加 mTORC1（p-mTOR-2448）和 CDK9（p-CDK9-186）的磷酸化水平，而 Nef/AXXA 突变体则无此作用，说明 Nef 通过招募 SFKs 激活了 mTORC1/CDK9 轴。
综合这些实验结果，明确了 Nef 通过招募 SFKs 激活 PI3K/AKT/mTOCR1 通路，进而激活 HIV-1 前病毒 DNA 转录。
Naf1 蛋白：看似矛盾的 “双面角色”
Naf1 蛋白是与 HIV-1 Nef 相关的宿主蛋白，广泛存在于人体组织中，尤其是外周血淋巴细胞。研究发现，Nef 诱导的 HIV 前病毒 DNA 转录依赖于 Naf1 的表达。在 C11 细胞中，用特异性 shRNA 敲低 Naf1 后，Nef 诱导的 HIV-1 前病毒 DNA 转录完全被抑制，同时 Nef 诱导的 mTORC1 和 CDK9 磷酸化也受到影响。
然而，Naf1 却是 PI3K/AKT/mTOCR1 通路的抑制因子。在 C11 细胞中转染 Naf1 表达质粒后，PI3K p85 亚基、AKT、mTORC1 以及下游 P70S6K 的磷酸化水平会随 Naf1 过表达呈剂量依赖性降低，同时 mTORC1 和 CDK9 的磷酸化也受到抑制；相反，敲低 Naf1 则会增强这些蛋白的磷酸化。在没有 Nef 存在时，敲低 Naf1 会增加 LTR 驱动的转录，并增强病毒复制；但在有 Nef 存在时，敲低 Naf1 会消除 Nef 对病毒复制的促进作用。这一系列实验表明，尽管 Naf1 是 PI3K/AKT/mTOCR1 通路的抑制因子，但它却是 Nef 促进 LTR 转录所必需的。
Nef 与 Naf1 的 “秘密联系”：Src 激酶介导的磷酸化
为什么 Nef 促进前病毒 DNA 转录需要依赖 Naf1 这个抑制因子呢？研究人员发现，Naf1、Nef 和 Src 之间存在关联。在 HEK293T 细胞实验中，转染 Nef 表达质粒后，通过免疫沉淀和免疫印迹检测发现，Nef 能与 Naf1 和 Src 共免疫沉淀，说明它们之间存在相互作用。
激活的 SFKs 会通过磷酸化酪氨酸残基来修饰下游蛋白。Naf1 含有多个酪氨酸残基，其中 Y552 位点的磷酸化可激活 PI3K 通路。研究发现，Nef 能招募 Src 激酶磷酸化 Naf1 的 Y552 位点。在 HEK293T 细胞中过表达 Nef，会诱导内源性 Src 在 Try-416 位点磷酸化，同时显著提高内源性和转染的 Naf1 在 Y552 位点的磷酸化水平；而 Nef AXXA 突变体由于无法招募 Src，不能诱导 Src 和 Naf1 的磷酸化。在 C11 细胞和 PHA-P 激活的原代 CD4+ T 细胞中转染 Nef 表达质粒，同样能促进 Naf1-Y552 和 / 或 Src 的磷酸化。在病毒感染实验中，感染野生型 HIV-1 的细胞中 Naf1 磷酸化水平比感染 Nef 缺陷型病毒的细胞更高，用逆转录酶抑制剂齐多夫定（AZT）阻断病毒复制后，Naf1-Y552 的磷酸化消失。免疫沉淀实验还证实，磷酸化的 Naf1-Y552 能与 Nef 结合。免疫荧光实验进一步表明，Nef 能招募 Src 与 Naf1 共定位，Nef AXXA 突变体则无此作用，而模拟磷酸化的突变体 Naf1-Y552D 可招募 Src 与 Naf1 共定位。这些实验充分证明，Nef 招募 Src 激酶磷酸化 Naf1 的 Y552 位点。
Naf1-Y552 磷酸化的 “神奇效果”：激活通路与促进转录
Naf1 在 Y552 位点的磷酸化是否会导致其功能改变呢？研究人员构建了 Naf1 的模拟磷酸化突变体 Y552D 和未磷酸化突变体 Y552F。免疫沉淀结果显示，Y552D 突变体能与 PI3K 的 p85 亚基强烈结合，而 Y552F 突变体则不能；免疫染色实验表明，Y552D 突变体与 Src 共定位。在细胞信号通路检测中，Y552D 突变体能增强 PI3K 亚基 P85、AKT、mTORC1 和 CDK9 的磷酸化，激活 PI3K/AKT/mTORC1/CDK9 信号通路，而 Y552F 突变体则无此效果。
在对 HIV 前病毒 DNA 转录的影响方面，在 C11 细胞中导入含有野生型 Naf1、Y552D 或 Y552F 突变体的慢病毒，结果显示 Y552D 突变体能激活 HIV-1 前病毒转录，表现为 GFP 表达增强和 gag mRNA 产量增加，而 Y552F 突变体则不能。
HIV-1 5′-LTR 驱动的转录需要 Tat 蛋白结合到 TAR 区域，招募包括 CDK-9/Cyclin T1 复合物在内的正转录因子。虽然 Naf1 磷酸化不会诱导 Cyclin T1 的表达，但过表达 Y552D 突变体可显著促进 Cyclin T1 与核小体（NUC1、NUC2）的结合，在 HIV-1 潜伏感染的 CD4+ CEM 细胞 ACH2 中也得到了相同的结果。
在评估 Naf1 对病毒感染的调节作用时发现，在 Jurkat CD4+ T 细胞中转染 Naf1 表达质粒后感染病毒，Naf1 能抑制 HIV-1 NL4-3（?Nef）的感染，但对含有 Nef 的 HIV-1 NL4-3 感染的抑制作用则被消除。同样，Naf1 过表达会抑制 LTR 驱动的基因表达，但转染 Nef 后这种抑制作用也会消失。这些结果表明，Naf1-Y552 磷酸化激活 PI3K/AKT/mTORC1 信号通路，消除了 Naf1 对 HIV 前病毒 DNA 转录的抑制作用。
研究意义：照亮 HIV 研究的新 “灯塔”
作为多功能致病因子，Nef 在调节 HIV-1 潜伏期方面的作用一直备受关注，但具体细胞机制并不完全清楚。本研究首次明确了 Nef 通过激活 PI3K/AKT/mTOCR1/CDK9 细胞通路来调节 HIV-1 前病毒 DNA 转录的机制。
Naf1 作为与 Nef 相互作用的蛋白，其在调节 HIV-1 转录中的作用十分独特。它既是 PI3K/AKT/mTOCR1 通路的抑制因子，又在 Nef 存在的情况下，通过 Y552 位点的磷酸化转变为促进前病毒转录的 “帮手”。这种依赖于磷酸化状态的双向调节作用为理解 HIV-1 感染机制提供了新的视角。
该研究揭示了宿主限制因子与 HIV-1 蛋白之间一种全新的相互作用模式，为深入研究 HIV-1 感染过程提供了关键线索，有望为开发更有效的抗病毒治疗策略提供理论依据，在 HIV 研究领域具有重要的科学价值和潜在的应用前景。
