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本文聚焦埃及伊蚊唾液腺蛋白 AgBR1 和 NeSt1 在寨卡病毒（ZIKV）传播中的作用。通过解析 AgBR1 晶体结构、开展细胞实验，发现其虽无典型酶活性，但能调节宿主细胞免疫反应和病毒进入途径，为防控 ZIKV 传播提供新思路。
研究背景
节肢动物传播的疾病是全球健康的重大威胁，蚊子作为多种病原体的传播媒介，其唾液中含有多种具有生物活性的蛋白质，这些蛋白质在病原体传播过程中发挥着重要作用。埃及伊蚊（Aedes aegypti）可传播寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）等多种病毒，其唾液腺蛋白 AgBR1 和 NeSt1 近年来受到关注，研究发现它们能诱导中性粒细胞募集，影响 ZIKV 的早期感染。然而，人们对这两种蛋白在宿主细胞中的作用机制以及它们在抗病毒治疗开发方面的潜力了解有限。
实验方法
- 蛋白克隆、表达与纯化：从埃及伊蚊唾液腺克隆 AgBR1 和 NeSt1 基因，构建表达载体，在 HEK 293T 和 HEK 293F 细胞中表达，经镍亲和层析和尺寸排阻色谱纯化。
- 基因点突变验证：对埃及伊蚊胡志明（HCM）株 AgBR1 基因的点突变进行验证，通过提取 mRNA、逆转录、克隆和测序等步骤确认突变。
- 晶体结构相关实验：筛选 AgBR1 结晶条件，收集衍射数据，用分子置换法解析结构并进行精修和分析。
- 结合实验：采用酶联免疫吸附测定（ELISA）和核磁共振（NMR）光谱技术检测 AgBR1 和 NeSt1 与 ZIKV、chitobiose 和 chitinhexaose 的结合情况。
- 细胞相关实验：提取小鼠骨髓来源的巨噬细胞（BMDM），进行免疫荧光显微镜观察、定量 PCR 分析 ZIKV 复制、体外刺激 BMDM 细胞并进行蛋白质组学分析，使用 STRING 和 Ingenuity Pathway Analysis（IPA）软件分析数据。
- 构建系统发育树：选取 GH18 家族的 13 个晶体结构与 AgBR1 结构进行比较，构建基于结构的系统发育树。
实验结果
- AgBR1 基因序列多态性：HCM 株 AgBR1 基因与利物浦株（LVP）相比存在点突变，导致蛋白水平的 K190E 突变，该突变位于 α4 螺旋和无序环附近。
- AgBR1 结构特征：AgBR1 具有 GH18 家族几丁质酶折叠，核心结构为 TIM 桶，包含八个 α - 螺旋和八个 β - 折叠。其活性位点存在突变（E157Q 和 A155D），导致酶活性丧失，成为几丁质酶样蛋白（CLP）。与其他 CLP 相比，AgBR1 的环区长度和构象存在差异，影响其与底物的结合。
- 与病毒及糖类的相互作用：ELISA 和 NMR 实验表明，AgBR1 和 NeSt1 均不与 ZIKV 直接相互作用。NMR - STD 光谱显示，AgBR1 不结合 chitobiose 和 chitinhexaose。
- 对病毒复制的影响：感染 ZIKV 的 BMDM 细胞在添加 AgBR1 后，病毒载量无显著变化，说明 AgBR1 不影响病毒复制。
- 对细胞信号通路的影响：蛋白质组学分析显示，AgBR1 和 NeSt1 刺激 BMDM 细胞后，分别有 55 和 37 种蛋白质表达差异显著，15 种蛋白质受两者共同影响。STRING 和 IPA 分析表明，这些蛋白质主要与免疫反应、细胞存活和增殖以及病毒进入途径相关，其中 “病毒通过内吞途径进入” 是两者共同影响的重要通路。
- 结构比较与系统发育树：基于结构的系统发育树显示，GH18 家族几丁质酶分为三个分支，AgBR1 与其他真核生物的 CLP 结构相似，但存在结构差异，这些差异可能与功能改变有关。
讨论
- 蛋白功能的转变：AgBR1 虽属于 GH18 家族几丁质酶，但由于活性位点突变和结构变化，丧失了典型的几丁质酶活性和结合糖类的能力，可能演变为一种信号蛋白，通过与细胞受体结合调节免疫反应。
- 对病毒传播的影响：AgBR1 和 NeSt1 虽不直接结合 ZIKV 或影响其复制，但能调节 BMDM 细胞的蛋白质组，影响病毒进入途径和免疫反应，可能通过增强病毒内化等机制促进 ZIKV 传播。
- 与其他研究的关联：与其他埃及伊蚊唾液腺蛋白的研究结果相比，AgBR1 和 NeSt1 对病毒复制和免疫反应的影响具有独特性，它们在不同细胞类型和实验条件下表现出不同的作用。
- 研究意义与展望：本研究揭示了 AgBR1 和 NeSt1 在 ZIKV 传播中的作用机制，为开发阻断蚊媒疾病传播的策略提供了理论依据，未来可进一步研究其在体内的作用以及与其他病原体的相互作用。
