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在奶牛遗传学研究中，全基因组关联研究（GWAS）虽能找到与农艺性状相关的遗传变异，但难以确定因果变异，限制了基因组预测准确性。研究人员通过整合 GWAS、大规模平行报告分析（MPRA）和计算机剪接预测数据，分析剪接破坏变异体（SDV），确定 3 个推定因果变异体，为奶牛遗传改良提供关键信息。
在奶牛养殖领域，精准遗传改良一直是提升奶牛生产性能、优化养殖效益的关键目标。随着基因测序技术的飞速发展，全基因组关联研究（GWAS）成为探寻奶牛遗传奥秘的有力工具。研究人员利用 GWAS 对奶牛众多农艺性状进行研究，成功识别出大量与性状相关的遗传变异。然而，这些变异大多只是与真正因果变异处于连锁不平衡状态的标记，并非真正影响性状的关键因素。这就好比在复杂的遗传迷宫中，研究人员虽然找到了一些线索，但这些线索并不能直接指向宝藏所在，使得准确的基因组预测难以实现，奶牛遗传改良的进程受到阻碍。为了突破这一困境，深入理解奶牛复杂性状的遗传基础，法国巴黎萨克雷大学（Université Paris-Saclay）等机构的研究人员开展了一项意义重大的研究。他们致力于剖析剪接变异体在奶牛复杂性状形成中的作用机制，旨在挖掘出真正的因果变异，为奶牛的精准遗传改良提供坚实的理论依据。这项研究成果发表在《Nature Communications》上，为奶牛遗传学领域带来了新的曙光。
研究人员采用了多种关键技术方法。首先是全基因组关联研究（GWAS），对不同品种奶牛的多性状进行分析，获取大量遗传数据。其次，运用大规模平行报告分析（MPRA）中的 Vex-seq 方法，对剪接变异体进行实验验证。同时，借助 SpliceAI 和 Pangolin 等生物信息学算法预测剪接变异体，综合多方面数据进行分析。
GWAS 分析
研究人员对荷斯坦（Holstein）、夏洛莱（Charolaise）、蒙贝利亚（Montbéliarde）和诺曼底（Normande）四个品种的奶牛进行 GWAS 分析，涉及牛奶生产、繁殖、抗病、生长及体型等 20 个性状。从 2500 万个双等位基因单核苷酸多态性（SNP）中筛选，最终确定 138,971 个候选变异，分布于牛常染色体上。其中，6 号染色体变异数量最多，不同品种奶牛的候选变异在数量和相关性状上存在差异。例如，荷斯坦奶牛与牛奶蛋白和脂肪含量相关的候选变异较多，而夏洛莱奶牛则与 30 月龄肌肉评分相关的候选变异较多。这一结果为后续研究提供了丰富的遗传数据基础，让研究人员初步了解了不同性状在基因组中的分布特征。
SpliceAI 和 Pangolin 的应用评估
SpliceAI 和 Pangolin 原本是用于分析人类遗传变异的深度学习剪接预测算法。由于哺乳动物剪接代码具有高度保守性，研究人员尝试将其应用于奶牛基因组分析。通过对 24 个已报道的奶牛 SDV 进行分析，发现这两个程序在高召回阈值（score ≥0.2）下，预测 SDV 的阳性率均为 70.8%，但对内含子变异的预测错误率较高。进一步利用 Var.GWAS 和 Var.P 数据集评估，结果显示 Pangolin 在剪接预测性能上略优于 SpliceAI，其平均受试者工作特征曲线下面积（AUC）为 0.831，而 SpliceAI 为 0.775。这表明在奶牛基因组背景下，虽然这两个程序都有一定的预测能力，但 Pangolin 的表现更为出色，为后续筛选剪接变异体提供了更可靠的工具选择。
Vex-seq 实验
研究人员构建了 Var.GWAS 和 Var.P 数据集，并使用 Vex-seq 方法对其进行分析。在实验过程中，对质粒文库进行严格质量控制，确保数据的可靠性。结果显示，约 75% 的变异在 HEK293T 或 MAC-T 细胞中得到验证，且两个细胞系的预测剪接指数（PSI）和 ΔPSI 值相关性良好，表明 Vex-seq 实验结果稳定可靠。通过设定 ΔPSI 阈值（±5%）和错误发现率（FDR <0.05 或 0.01），在 Var.GWAS 和 Var.P 数据集中分别鉴定出一定比例的 SDV，其中 Var.P 数据集的 SDV 比例更高。这一实验不仅验证了部分变异的剪接效应，还为后续因果变异的筛选提供了重要依据。
剪接变异体的特征分析
研究发现，影响系统发育保守核苷酸的变异在降低剪接率的变异组中显著富集，这意味着保守区域的变异更有可能对剪接产生重要影响。同时，GWAS 中与最严重剪接改变相关的变异，其替代等位基因频率往往较低。在研究的 182 个数量性状位点（QTL）中，约 11.2%（22 个）至少包含一个 SDV，若考虑实验局限性进行校正，该比例预计可达 57%，表明 SDV 在 QTL 中广泛存在，对奶牛复杂性状的影响不容忽视。这些发现进一步揭示了剪接变异体与奶牛遗传性状之间的紧密联系。
因果 SDV 的鉴定
通过综合分析变异与表型的统计关联、变异对基因功能的预测影响以及基因与表型之间的功能联系，研究人员从 38 个 SDV 中鉴定出 3 个推定因果变异：rs134725785（位于 DGAT1 基因）、rs135835897（位于 PIK3C2G 基因）和 rs133242826（位于 PIAS4 基因）。rs134725785 可增加 DGAT1 表达，影响牛奶表型；后两个基因虽作用机制尚不明确，但根据已有研究推测，PIK3C2G 可能调节牛奶脂肪含量，PIAS4 可能参与调节骨骼发育和体重相关性状。这一成果为奶牛复杂性状的遗传解析提供了关键线索，有望推动奶牛遗传改良的实践应用。
SDV 与 eQTL/sQTL SNP 的共定位分析
研究人员对 38 个 SDV 与表达数量性状位点（eQTL）/ 剪接数量性状位点（sQTL）SNP 进行共定位分析，发现 71.1%（27/38）的 SDV 至少与一个单组织或多组织的 e/sQTL SNP 共定位。这一结果进一步支持了这些变异是真正 SDV 的观点，同时表明 SDV 与基因表达和剪接调控密切相关，为深入理解奶牛复杂性状的遗传调控网络提供了重要依据。
在这项研究中，研究人员成功鉴定出与奶牛复杂性状相关的剪接变异体，并确定了 3 个推定因果变异，揭示了 SDV 在奶牛复杂性状形成中的重要作用。这不仅有助于深入理解奶牛的遗传机制，还为奶牛的基因组选择和遗传改良提供了关键信息，有望推动奶牛养殖业的可持续发展。然而，研究也存在一定局限性，如未纳入深内含子变异分析，部分 SDV 对蛋白质功能的影响难以明确等。未来研究可进一步拓展研究范围，深入探究 SDV 的作用机制，为奶牛遗传改良提供更全面、精准的理论支持 。
