S - 亚硝基化修饰 EZH2：调控内皮稳态的新机制与潜在治疗靶点

为探究一氧化氮（NO）介导的 EZH2 蛋白翻译后修饰对其功能的影响，研究人员开展了关于 S - 亚硝基化修饰 EZH2 的研究。结果发现 S - 亚硝基化修饰影响 EZH2 稳定性、功能及 PRC2 复合物，维持内皮稳态。这为相关疾病治疗提供新思路。

　　在生命的微观世界里，细胞的正常运作依赖于各种精细的调控机制。一氧化氮（NO）作为一种多功能的生物活性分子，在细胞功能调节中扮演着重要角色，它可通过 S - 亚硝基化修饰蛋白质来发挥作用。EZH2 是多梳抑制复合物 2（PRC2）的关键功能性酶组分，负责催化组蛋白 H3 第 27 位赖氨酸的甲基化（H₃K27me₃），进而调控基因表达，在细胞分化、发育以及多种疾病进程中都有着举足轻重的地位 。此前，虽然 NO 信号通路对血管内皮细胞基因表达有影响，但 NO 依赖的蛋白质 S - 亚硝基化修饰在定义内皮细胞表观遗传景观中的作用尚不明确，EZH2 的 S - 亚硝基化修饰及其对该关键表观遗传调节因子的催化活性、定位和降解的影响也未见报道。为了填补这些知识空白，来自印度比拉理工学院（Birla Institute of Technology and Science）的研究人员开展了深入研究，相关成果发表在《Nature Communications》上，为理解内皮细胞功能调控及相关疾病治疗提供了新的视角。

研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：一是使用生物素开关法（biotin switch assay）和碘代串联质谱标签（iodoTMT）标记试剂检测 EZH2 的 S - 亚硝基化；二是通过免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）实验探究蛋白质之间的相互作用；三是利用染色质免疫沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）及后续的定量 PCR 分析基因启动子区域 H₃K27me₃的富集情况；四是借助分子动力学（MD）模拟从结构层面分析 S - 亚硝基化对 EZH2-SUZ12 复合物的影响。

SNP/GSNO 与 EZH2 的相互作用及对相关指标的影响

研究人员以硝普钠（SNP）作为外源性 NO 供体，发现 SNP 处理人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和人脐静脉内皮细胞系（EA.hy926 细胞）后，细胞内亚硝酸盐水平呈时间依赖性增加。SNP 可使 EZH2 蛋白及其催化产物 H₃K27me₃水平降低，且 H₃K27me₃水平在 SNP 处理 1 小时后就显著下降，早于 EZH2 蛋白在 2 小时后的降解。进一步研究表明，SNP 处理 30 分钟时，SUZ12 就从 EZH2 结合的 PRC2 复合物上解离，导致 PRC2 复合物催化活性降低。同时，SNP 促使 EZH2 发生胞质转位，通过亚细胞分级分离和免疫荧光实验得以证实。为排除 SNP 作用的非特异性，研究人员使用 S - 亚硝基谷胱甘肽（GSNO）进行实验，得到了相似的结果，且 GSNO 处理后 EZH2 的相互作用蛋白发生改变，通过质谱分析鉴定出了相关变化的蛋白。

EZH2 的 S - 亚硝基化修饰及对 PRC2 复合物活性的影响

研究人员通过体外无细胞系统和细胞实验证实，NO 处理可使 EZH2 蛋白发生 S - 亚硝基化修饰。生物素开关法和免疫沉淀实验表明，在 EA.hy926 细胞中，NO 处理后 EZH2 蛋白被 S - 亚硝基化。同时，使用天然诱导剂缓激肽（bradykinin）诱导内源性 NO 产生，也检测到 EZH2 蛋白的 S - 亚硝基化及与 SUZ12 结合的丧失。此外，H₃K27me₃组蛋白甲基转移酶（HMT）活性测定显示，SNP 或 GSNO 处理后，PRC2 复合物的甲基转移酶活性显著降低，说明 EZH2 的 S - 亚硝基化导致 SUZ12 从 PRC2 复合物上早期解离，进而降低其催化活性。

EZH2 降解途径及内源性 NO 抑制的影响

研究发现，S - 亚硝基化的 EZH2 主要通过自噬溶酶体途径降解。使用蛋白酶体抑制剂 MG132 不能逆转 SNP 处理后 EZH2 的降解，而自噬溶酶体途径抑制剂巴弗洛霉素 A1（bafilomycin A1）可部分逆转。同时抑制蛋白酶体和自噬溶酶体途径，能完全逆转 EZH2 的降解，但无法恢复 H₃K27me₃的水平。此外，抑制内源性 NO 产生机制，如使用 eNOS siRNA 敲低 HUVEC 细胞中的 eNOS，或用 L-NAME 抑制一氧化氮合酶（NOS），可逆转由 VEGF 或缓激肽诱导的 EZH2 和 H₃K27me₃水平的降低，且限制 EZH2 的胞质转位，使其定位在细胞核中。

EZH2-H₃K27me₃轴在糖尿病肾病中的作用及调节效果

研究人员发现，在糖尿病肾病中，EZH2-H₃K27me₃轴增强。预先用 H₃K27me₃特异性去甲基化酶抑制剂 GSK-J4 处理细胞，可逆转 SNP 诱导的 H₃K27me₃水平降低，并抑制 SNP 诱导的内皮细胞迁移。通过实时定量 PCR（qPCR）和染色质免疫沉淀实验发现，SNP 处理后，与内皮功能相关的基因如 VEGFa、TBX20 等的转录水平增加，且这些基因启动子区域 H₃K27me₃的富集减少。在高糖环境下，GSNO 处理可逆转高糖诱导的 EC 和大鼠主动脉中 EZH2、H₃K27me₃水平的升高以及炎症黏附分子 ICAM1 的表达，减少单核细胞黏附，这表明 S - 亚硝基化介导的 EZH2 调节可能是对抗糖尿病血管并发症的潜在治疗策略。

EZH2 特定半胱氨酸残基 S - 亚硝基化的作用及分子机制

通过预测工具发现 EZH2 蛋白的半胱氨酸 329（C329）、700（C700）等位点可能发生 S - 亚硝基化。构建点突变体实验表明，C329S 突变体对 SNP 处理不敏感，其 EZH2 蛋白水平未受影响，但 H₃K27me₃水平显著降低；C700S 突变体的 EZH2 蛋白水平在 SNP 处理后显著下降，而 H₃K27me₃水平不变。双突变体 EZH2 C329S C700S 对 SNP 完全不敏感。免疫荧光和共聚焦成像显示，SNP 可诱导野生型 EZH2 的胞质转位，但对 C329S 和双突变体无此作用。分子动力学模拟显示，EZH2 在 C329 和 C700 位点的 S - 亚硝基化导致 EZH2-SUZ12 复合物构象改变，使 SUZ12 与 EZH2 的 SAL 结构域结合减弱，最终导致复合物不稳定。

综上所述，该研究揭示了 NO 信号通路通过 S - 亚硝基化修饰 EZH2 的 C329 和 C700 残基，影响 PRC2 复合物的稳定性和催化活性，进而调控基因表达，维持内皮稳态。在糖尿病等疾病状态下，S - 亚硝基化修饰 EZH2 可能成为潜在的治疗靶点。不过，研究也存在一定局限性，如未能在体内模型中证实 eNOS 基因表达或催化抑制对 EZH2 和 H₃K27me₃的影响。未来研究可进一步探索 NO 依赖的表观遗传通路调控机制，为相关疾病的治疗提供更坚实的理论基础和潜在的治疗策略。