基于废弃物氮源优化的Komagataella pastoris高效生产β-葡萄糖苷酶的培养基开发研究

本研究针对甲醇诱导型启动子(AOX1P)系统的安全隐患及高成本问题，通过构建pGAPZαA表达载体，利用组成型GAP启动子(GAPP)在Komagataella pastoris中表达Phanerochaete chrysosporium β-葡萄糖苷酶(Pccbgl1)。创新性地采用大豆乳清(soy whey)和啤酒废酵母(BSY)等废弃物替代传统BMGY培养基的氮源，使酶活提升2.71倍，其中SMb培养基在1-L发酵中达到120 U/g DCW的产率，为工业规模重组蛋白生产提供了经济高效的解决方案。

　　

在生物技术领域，高效经济的重组蛋白生产始终是核心挑战。传统甲醇诱导型表达系统(AOX1_P)虽能实现高产量，但甲醇的毒性、易燃性及代谢产生的过氧化氢会损害蛋白稳定性，尤其限制其在食品药品领域的应用。与此同时，培养基成本占工业酶生产总成本的30-50%，其中氮源支出尤为显著。Komagataella pastoris（旧称Pichia pastoris）作为真核表达系统，兼具遗传可操作性和高密度发酵优势，其组成型GAP启动子(GAP_P)系统可规避甲醇风险，但培养基优化研究仍显不足。

针对上述问题，研究人员以工业关键酶β-葡萄糖苷酶为报告基因，该酶能水解纤维素降解中的限速步骤——纤维二糖转化为葡萄糖。通过改造pGAPZαA载体构建双宿主表达系统pGAPM-Pccbgl1，在K. pastoris和Saccharomyces cerevisiae中分别实现0.26 U/mL和0.52 U/mL的酶活。研究重点创新在于采用大豆加工废料（含46.98%氨基酸的K. pastoris生物质）、啤酒废酵母(BSY)和玉米浆等替代传统YNB氮源。

关键技术包括：1）构建含2-micron序列的双宿主表达载体；2）采用Sh ble抗性基因筛选转化子；3）设计简单培养基(SM)配方对比标准BMGY和BSM；4）1-L批次发酵评估。

研究结果
功能性表达验证：Western blot证实Pccbgl1在两种酵母中正确分泌，S. cerevisiae表现出更高基础酶活，但K. pastoris在后续优化中展现更大潜力。

氮源替代优化：大豆乳清使摇瓶培养酶活达0.60 U/mL（较BMGY提升2.07倍），而含BSY的SMb培养基在发酵罐中创下2.79 U/mL的容积活性和120 U/g DCW的比生产率，较标准BSM提升23%。

发酵性能比较：30小时好氧培养显示，SMb的产率(4.0 U/g DCW/h)显著高于BSM(2.8 U/g DCW/h)，但含大豆乳清的SMs因复杂蛋白干扰下游纯化，仅达1.63 U/g DCW/h。

结论与意义
该研究首次系统评估废弃物氮源对K. pastoris重组蛋白生产的影响，证实BSY可替代昂贵有机氮源，使培养基成本降低60%以上。SMb培养基的卓越性能（接近BSM的1.2倍产率）为工业规模生产提供绿色解决方案，同时缓解食品加工业环保压力。值得注意的是，废弃物中的杂蛋白需通过预处理解决，这对高纯度药品生产尤为重要。论文发表于《Biocatalysis and Agricultural Biotechnology》，为循环生物经济模式提供了关键技术支撑。