揭秘囊性纤维化中氧化葡萄糖酸无色杆菌蛋白抗原：抗体引导下的新发现及潜在诊断价值

本文聚焦囊性纤维化（CF）中氧化葡萄糖酸无色杆菌（Achromobacter xylosoxidans）感染。研究通过血清抗体筛查、抗原亲和纯化及质谱分析等，鉴定出 8 种抗原，其中 3 种特异性较高。这些抗原或可用于血清学检测，助力 Achromobacter 感染的诊断与监测。

　　

引言

囊性纤维化（CF）是由 CF 跨膜调节因子（CFTR）基因突变引起的单基因疾病。突变导致氯离子跨细胞膜转运受损，使得气道和胰腺导管中异常浓稠的黏液积聚。这种黏性的 CF 黏液为细菌感染创造了有利环境，持续的呼吸道感染和由此引发的气道炎症会导致进行性肺损伤，最终引发呼吸衰竭，这也是 CF 患者的主要死因。

无色杆菌属（Achromobacter spp.）是一类环境革兰氏阴性菌，能够在 CF 患者（pwCF）中引起机会性气道感染。氧化葡萄糖酸无色杆菌（A. xylosoxidans）是 pwCF 中最常被鉴定出的无色杆菌物种，此外还有 A. insuavis 等。持续的无色杆菌感染与患者肺功能下降、静脉使用抗生素需求增加、肺部恶化更频繁以及肺移植风险升高等相关，但目前尚不清楚无色杆菌是这些不良后果的直接诱因，还是仅仅作为其他因素导致低肺功能的一个指示。

与常见的 CF 病原体如铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）相比，人们对无色杆菌的致病机制和宿主对其的免疫反应了解较少。此前有研究表明，感染无色杆菌的 pwCF 会产生针对该细菌的抗体反应，但具体的抗原靶点尚未明确。本研究旨在利用基于质谱的系统抗原组学方法，鉴定出能被宿主抗体识别的无色杆菌表达蛋白。

材料和方法

• 人类血清和细菌分离株：血清样本来自瑞典隆德斯科讷大学医院 CF 中心的成年 CF 患者。气道培养中多次检测到无色杆菌属细菌生长的个体被视为存在无色杆菌气道感染；根据利兹标准，铜绿假单胞菌慢性感染定义为在≥50% 的气道培养中出现该菌生长。健康个体的血清作为对照。实验使用的 A. xylosoxidans 56,438^T、A. insuavis 62,426^T菌株购自瑞典哥德堡大学菌种保藏中心，铜绿假单胞菌 PAO1 参考菌株由隆德大学 Arne Egesten 教授馈赠，临床无色杆菌分离株则来自瑞典隆德斯科讷大学医院临床微生物学系，并经标准实验室方法及 nrdA 测序进行菌种鉴定。
• 血清 IgG 与全菌结合的 ELISA 检测：将 A. xylosoxidans、A. insuavis 或铜绿假单胞菌的 3 - 4 个菌落悬浮于包被缓冲液，加入 96 孔微量滴定板，37℃、5% CO₂孵育过夜后，80℃加热 15 分钟杀死细菌。用 5% BSA 的 PBST 缓冲液封闭非特异性结合位点，将血清 1:100 稀释后加入孔中孵育 1 小时，洗涤后加入 Protein G - HRP 共轭物，再次孵育、洗涤，最后加入显色液，在 420nm 处读取吸光度，以健康对照组平均 OD 值 + 3 倍标准差作为阳性判断阈值。
• 细菌分泌蛋白和表面蛋白的制备：A. xylosoxidans 在添加特定成分的 ABT 培养基中过夜培养，次日转接培养至对数中期，离心收集培养物。分泌蛋白从培养上清中经 0.22μm 滤膜过滤、10kDa 超滤柱离心纯化获得；表面蛋白则从细菌沉淀中经胰蛋白酶处理、加热灭活后，用 Pierce BCA 蛋白检测试剂盒测定浓度并保存。
• 蛋白质免疫印迹（Western blot）：将细菌蛋白与上样缓冲液混合，85℃变性 10 分钟后进行 SDS - PAGE 凝胶电泳，再转膜至硝酸纤维素膜，用 5% BSA 的 PBST 缓冲液封闭，与稀释的人血清 4℃孵育过夜，洗涤后与 Protein G - HRP 共轭物 37℃孵育 1 小时，最后用化学发光底物显色并成像。
• 细菌抗原的亲和纯化：分别使用来自感染 A. xylosoxidans 的 pwCF 血清（CF_Achro）、感染铜绿假单胞菌的 pwCF 血清（CF_PsA）、健康对照血清、奥马珠单抗（omalizumab，Xolair）和药用级静脉注射免疫球蛋白 G（IVIG）的 IgG 对细菌蛋白进行亲和纯化。将 Pierce Protein G 磁珠洗涤后，与免疫球蛋白样本孵育，再与细菌蛋白混合孵育过夜，洗涤后用 0.1M 甘氨酸洗脱 IgG - 抗原复合物，中和 pH 后进行 SDS - PAGE 凝胶电泳并染色验证。
• 质谱样品制备和液相色谱 - 串联质谱（LC - MS/MS）分析：将亲和纯化及细菌蛋白样品均质化、变性、还原、烷基化处理后，用胰蛋白酶酶解，再经 C18 柱纯化、浓缩、复溶，用 Q Exactive HFX 仪器在数据依赖采集（DDA）模式下进行 LC - MS/MS 分析。
• 数据分析和统计：DDA 数据在 MaxQuant 软件中分析，使用 A. xylosoxidans 参考蛋白质组，设置相关修饰参数，以错误发现率（FDR）0.01 进行鉴定。进一步在 Perseus 软件中过滤数据，去除相关杂质数据，对符合条件的数据进行 log2 转换和缺失值填补，通过双尾 t 检验（FDR 0.05）确定抗原性命中蛋白。
• 重组蛋白表达和血清 IgG 与重组蛋白结合的 ELISA 检测：将 3 种推定抗原（二氢硫辛酰胺脱氢酶 DLD、I 型分泌 C 末端靶结构域蛋白 T1S - DCP、功能未知结构域 336 DUF336）的氨基酸序列提交至 Protein Production Sweden，在大肠杆菌中重组表达。将重组蛋白稀释后包被 ELISA 板，按特定条件进行 ELISA 检测，测定血清 IgG 结合情况。
• PCR：将细菌菌落重悬于 PBS，100℃加热 5 分钟，离心取上清作为 PCR 模板。使用特定引物和 Taq 聚合酶进行常规 PCR，产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳检测。
• 局部比对搜索（基本局部比对搜索工具 BLAST）：使用 BLAST 的蛋白质 - 蛋白质模式，比较 A. xylosoxidans 的 DLD、T1S - DCP 和 DUF336 与 A. insuavis 和铜绿假单胞菌的序列相似性，选择最高相似性蛋白并进行多序列比对和评分。
• 统计学分析：使用 Perseus 软件的火山图进行抗原命中蛋白的富集分析（双尾 t 检验，FDR 0.05），ELISA 实验数据用 GraphPad Prism 10.0.2 软件进行统计分析，组间比较采用非参数 Mann - Whitney U 检验，P≤0.05 为差异具有统计学意义。

结果

• 无色杆菌感染引发 pwCF 的循环抗体反应：对 7 例无色杆菌气道感染的 pwCF 血清进行抗体滴度检测，发现 4 例（57%）对 A. xylosoxidans 和 A. insuavis 均有阳性血清滴度，且这 4 例均感染 A. xylosoxidans；而 2 例感染 A. insuavis 的患者血清中未检测到针对这两种无色杆菌的 IgG。CF_Achro组血清对 A. xylosoxidans 的 IgG 滴度显著高于 CF 对照组（P = 0.02），但对 A. insuavis 的滴度差异无统计学意义（P = 0.07）。此外，CF_PsA组血清对 A. xylosoxidans 和 A. insuavis 的中位滴度均显著高于 CF 对照组。CF_PsA组多数患者（64%）对铜绿假单胞菌有 IgG 滴度，而 CF_Achro组除 3 例合并感染铜绿假单胞菌的患者外，其余患者对铜绿假单胞菌无血清 IgG。通过 Western blot 检测发现，感染 A. xylosoxidans 患者血清与细菌分泌和表面蛋白有多个结合条带，而健康对照血清无结合。
• 无色杆菌蛋白抗原的鉴定：LC - MS/MS 分析鉴定出 A. xylosoxidans 分泌蛋白中有 357 种细菌蛋白，表面蛋白中有 1,163 种。利用系统抗原组学工作流程，通过与阴性对照奥马珠单抗比较，发现 8 种蛋白与 CF_Achro血清 IgG 显著相关，这些抗原主要存在于分泌和表面蛋白中，参与多种细胞功能。且这 8 种抗原在 IVIG 和健康供体血清的 IgG pulldowns 中均未出现，表明感染无色杆菌诱导的 IgG 反应具有高度特异性。
• 鉴定抗原对 A. xylosoxidans 的特异性：使用 CF_PsA血清进行 IgG 亲和纯化，与 CF_Achro血清比较，发现 4 种抗原（DLD、T1S - DCP、DUF336 和 ABC - TSBP）与 CF_Achro血清显著相关，其中 3 种（DLD、DUF336 和 ABC - TSBP）在 CF_PsA血清 pulldowns 中未被检测到。对 3 种重组表达抗原（DLD、T1S - DCP 和 DUF336）进行 ELISA 检测，结果显示 CF_Achro血清对这 3 种抗原均有高 IgG 滴度，而健康供体血清和 CF_PsA血清则无，证实了基于质谱的系统抗原组学工作流程鉴定出的特异性 A. xylosoxidans 抗原。
• 在更广泛 CF 队列中评估 A. xylosoxidans 抗原：BLAST 搜索和序列比对结果显示，DUF336 与 A. insuavis 和铜绿假单胞菌中的血红素结合蛋白相似度较高，DLD 在铜绿假单胞菌中有同源蛋白，T1S - DCP 在这两种菌中未发现同源蛋白。对 14 株 A. xylosoxidans 分离株进行 PCR 扩增，发现对应 3 种抗原的基因在所有分离株中均能扩增出，表明这些基因在 A. xylosoxidans 中普遍存在。在更大规模的血清队列 ELISA 检测中，71% 的 CF_Achro血清对 DLD 和 T1S - DCP 有阳性 IgG 滴度，43% 对 DUF336 呈阳性，T1S - DCP 特异性较低，而 DUF336 和 DLD 的抗体反应似乎对无色杆菌感染更具特异性。

讨论

本研究首次利用患者血清 IgG 亲和纯化细菌蛋白的方法，深入鉴定了能引发宿主抗体反应的氧化葡萄糖酸无色杆菌蛋白抗原。研究发现 8 种与 CF_Achro血清 IgG 相关的抗原，其中 4 种（T1S - DCP、DLD、DUF336 和 ABC - TSBP）与抗铜绿假单胞菌 IgG 无交叉反应，且这 4 种抗原在无色杆菌中的作用此前未被充分研究。

3 种抗原（T1S - DCP、DLD 和 DUF336）经重组表达后，在多个 CF_Achro血清中检测到针对它们的抗体滴度，且相应基因存在于所有测试的无色杆菌分离株中，因此这些抗原可能成为检测无色杆菌血清抗体的潜在候选物。随着 CFTR 调节剂疗法的应用，血清学检测在 CF 感染诊断中的作用可能更加重要，但 CF 病原体之间的抗体交叉反应可能限制血清抗体检测的实用性。本研究通过比较 CF_Achro和 CF_PsA血清 IgG 获取的抗原，排除了交叉反应抗原，结果表明 DLD 和 DUF336 有望用于血清学检测中特异性检测无色杆菌血清 IgG，但仍需在更大患者队列中进一步验证。

IgG 在气道免疫中发挥重要作用，在 CF 患者中，循环 IgG 滴度与肺功能和预后相关。本研究中感染 A. insuavis 的患者未产生循环 IgG，而感染 A. xylosoxidans 的患者多数有阳性血清滴度，推测这两种菌在致病性和免疫逃避模式上可能存在差异，但需更多临床研究证实。

本研究存在一定局限性，如 CF 患者中感染无色杆菌的血清样本量少，无法探究抗体滴度与感染持续时间、肺功能等的关系，且样本中同时存在 A. xylosoxidans 和 A. insuavis 感染，干扰了数据。此外，仅使用 1 份 CF_Achro血清样本鉴定抗原，可能遗漏其他相关抗原，且实验仅检测了特定生长条件下细菌表达的蛋白抗原及分泌和表面蛋白组分中的 IgG 靶点，体内生长时可能存在其他相关抗原。不过，已鉴定的蛋白抗原与全菌血清滴度呈现相似模式，仍能代表宿主对无色杆菌感染的抗体反应。

总体而言，多数感染 A. xylosoxidans 的 pwCF 会产生针对该菌的抗体反应。研究鉴定出 4 种特异性 A. xylosoxidans 抗原，其中 3 种经重组表达和 ELISA 验证，尤其是 DUF336 和 DLD 对感染 A. xylosoxidans 的 pwCF 血清具有较高特异性，或可用于开发血清学检测方法。