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本文通过对致病藻类（如 Prototheca 属）进行系统发育分析，利用新的细胞器编码基因明确 AHP 谱系内关系，并结合活细胞成像研究其与哺乳动物免疫反应的相互作用，发现吞噬作用存在宿主细胞和藻类物种依赖性，为确定新治疗靶点提供依据。
引言
Prototheca 是一类无叶绿素的绿色藻类，其中 6 种（Prototheca blaschkeae、Prototheca bovis、Prototheca ciferrii、Prototheca cutis、Prototheca miyajii 和 Prototheca wickerhamii）可感染哺乳动物致病 。Prototheca 属为并系群，其与 Auxenochlorella、Helicosporidium 等属组成的 AHP 谱系，在分类和系统发育关系上存在诸多不确定性。以往研究多聚焦于少数几种 Prototheca 物种，对整个 AHP 谱系与哺乳动物免疫的相互作用了解有限。本研究旨在利用新的细胞器编码基因明确 AHP 谱系内的高级关系，并通过活细胞成像探究 11 种 Prototheca 和 4 种 Auxenochlorella 物种与哺乳动物先天免疫反应的相互作用。
结果
- 致病物种间吞噬行为差异：先前研究发现，P. wickerhamii 和 P. bovis 在被小鼠巨噬细胞 J774A.1 吞噬时行为差异大，P. ciferrii 与 P. bovis 吞噬情况相似。本研究将 6 种致病物种暴露于 J774A.1 细胞，发现只有部分预测正确，如 P. miyajii 的吞噬指数表现特殊，与其他物种存在差异 。将这些物种暴露于人类单核细胞衍生的巨噬细胞（HMDMs）时，牛相关物种的吞噬指数显著高于人相关物种，且 P. miyajii 在人吞噬细胞中的表现与小鼠细胞中不同。
- cytb 部分序列支持 AHP 进化枝的单系性：以往基于 cytb 序列的系统发育研究存在局限性，本研究获取了更多 Chlorella 和 Micractinium 的序列数据，并对更多 Auxenochlorella 物种进行测序。构建的最大似然（ML）系统发育树显示，Chlorella 和 Micractinium 形成 AHP 进化枝的姐妹群，且 AHP 谱系内出现 6 个得到良好支持的组，部分组包含致病物种，部分不包含 。
- 其他细胞器序列揭示 AHP 谱系内的主要亚群和可能界限：选取 5 个细胞器基因组的基因（atp1、cox1、nad5、cysT 和 rpl2）构建系统发育树，结果支持 Chlorella 与 AHP 进化枝的分离，且多数基因支持 AHP 谱系内的深度分裂，分为两个主要亚群 。同时，通过分析细胞器基因组的整体结构，发现不同物种间存在基因重排现象，但这些结构变化不足以区分基于系统发育数据提出的较低层次的组。
- AHP 亚谱系中吞噬行为的一致性变化：根据系统发育和结构数据，将 AHP 物种分为 4 个亚谱系进行吞噬实验。结果表明，牛相关物种在 J774A.1 细胞和 HMDMs 中的吞噬程度最高，且组内物种间差异不显著 。进一步分析发现，不同组物种间的吞噬指数和平均摄取量存在差异，但组内物种在这些指标上大多相似，不过 P. miyajii 可能是个例外。此外，巨噬细胞对人相关和环境物种的吞噬作用显著降低，但仍会向这些物种迁移，且迁移动力学在不同物种间无显著差异。
讨论
本研究首次全面探究 Prototheca 与哺乳动物免疫系统的相互作用，还纳入了 Auxenochlorella 和 Chlorella 物种的序列，揭示了 AHP 谱系内的亚谱系及其与哺乳动物免疫相互作用的复杂性。不同 Prototheca 物种被小鼠巨噬细胞识别存在差异，可能原因包括：不同物种表面的病原体相关分子模式（PAMPs）不同，仅部分能被巨噬细胞模式识别受体（PRRs）识别；部分物种可能主动入侵巨噬细胞；部分物种可能主动抑制吞噬作用 。不同宿主来源的细胞对 Prototheca 物种的吞噬趋势也不同，可能是因为不同物种表面 PAMPs 不同，影响了宿主吞噬细胞的识别 。本研究存在局限性，未排除 AHP 谱系吞噬动力学的其他变异性，且研究的菌株有限，未来需进一步研究明确 Prototheca 的吞噬机制，收集更多菌株进行更深入的分析。
材料和方法
- 菌株：从多个合作者处获取菌株，为 AHP 菌株分配内部标识符。
- 藻类培养：在特定培养基上培养 Prototheca 和 Auxenochlorella 菌株，部分菌株因生长特性需特殊培养条件。
- DNA 提取和测序：从培养的细胞中提取 DNA，经一系列处理后进行 Illumina 测序。
- 基因组组装：使用 SPAdes 软件进行基因组组装，通过相关工具鉴定和提取代表完整细胞器基因组的 contigs。
- 系统发育分析：结合公共数据和本研究生成的数据，选择合适的基因和外群构建系统发育树，并分析细胞器基因组区域的排列。
- 组织培养：用藻类细胞感染 J774A.1 小鼠巨噬细胞或 HMDMs，培养条件不同。
- 吞噬实验和活细胞成像：处理藻类细胞后感染巨噬细胞，在特定条件下进行时间推移成像。
- 活细胞成像视频分析：使用 Fiji 软件对视频进行量化分析，计算吞噬指数和平均摄取量，还分析巨噬细胞迁移动力学的 4 个指标。
- 统计分析：使用 GraphPad Prism 软件进行统计分析，评估数据的显著性。
