4 - 戊烯酸影响荨麻青贮品质的探秘：抗菌机制大揭秘

本文聚焦荨麻青贮难题，研究发现戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）可降低荨麻青贮氨含量，提升品质，但 4 - 戊烯酸会干扰这一过程。4 - 戊烯酸通过抑制脂肪酸合成（fabG）和耐酸蛋白（accA）表达破坏菌细胞壁，为荨麻青贮研究提供新方向。

　　

引言

动物饲料资源稀缺促使人们开发非常规饲料，荨麻因对动物有诸多益处而受关注，如能改善动物性能、增强瘤胃健康、促进生长和提高抗病能力等。青贮是保存饲料营养的重要手段，但苜蓿等豆科植物青贮存在挑战，因其缓冲能力高、蛋白质含量高且水溶性碳水化合物（WSCs）含量低。相比之下，荨麻青贮难度更大，即便接种植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）且发酵底物中 WSC 含量充足，青贮过程仍不顺利，可能是荨麻对多种细菌有抑制作用。

有研究表明，接种片球菌（Pediococcus sp）可提高豆科植物青贮品质，其在荨麻青贮中相对丰度稳定，但荨麻中的一些物质可能抑制其活性。因此，本研究旨在探究片球菌对荨麻青贮特性的影响，并找出影响这些细菌的因素。

材料与方法

1. 菌株分离：从自然发酵的荨麻青贮中分离Pediococcus sp菌株，采用特定引物对其进行 16S rRNA 测序，测序工作由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，相关核苷酸序列数据已存入美国国立生物技术信息中心（NCBI），登录号为 “OL455604” 。
2. 青贮制备：于 2022 年 9 月 20 日在中国新疆天山中部沙湾县野外采集大麻叶荨麻（Urtica cannabina），使其萎蔫至鲜重约 370 g/kg 后切碎。从荨麻青贮自然发酵物中分离出戊糖片球菌（P. pentosaceus），用 MRS 液体培养基富集，经平板计数法确定乳酸菌数量后，将其均匀喷洒在青贮表面并混合均匀，装入带单向排气阀的塑料袋中。设置接种戊糖片球菌（浓度为 1×10⁶ CFU/g 鲜重）和喷无菌水作对照两组，在 24°C 下储存，设置 4 个发酵时间处理（7、15、30 和 60 天），每个处理 5 个重复。
3. 青贮特性分析：不同发酵时间后，取样品测定干物质（DM）含量，粉碎过筛后测定总氮、水溶性碳水化合物（WSC）等含量，用特定方法分析发酵特性，包括乳酸（LA）、乙酸（AA）、丙酸（PA）、pH 和氨（AN）水平。
4. 荨麻青贮细菌群落测序分析：选取青贮 7、30 和 60 天后的样品，提取总 DNA，对 16S rDNA 基因的 V3 - V4 区域进行 PCR 扩增，纯化后测序，所得序列存入 NCBI 数据库。
5. 自然发酵荨麻青贮代谢物分析：按照之前研究方法，在自然发酵的第 7、30 和 60 天采集新鲜样品，每个青贮 5 个重复。
6. 抗菌物质对P. pentosaceus的最小抑菌浓度测定：根据自然发酵条件下细菌与代谢物相关性分析结果，选择潜在抗菌物质，采用肉汤稀释法测定其对P. pentosaceus的最小抑菌浓度。
7. 抗菌物质胁迫下P. pentosaceus的生长情况：将细菌在添加不同浓度（0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8% 和 1.0%，体积比）抗菌物质的 MRS 肉汤中培养 72 小时，在不同时间测定 600 nm 处吸光度和 pH。
8. 透射电镜分析：根据生长结果，选择对P. pentosaceus抑制作用最强的物质。将细菌在含 0.8%（体积比）4 - 戊烯酸的 MRS 肉汤中培养 8 小时（对数生长期），离心收集细胞，固定、脱水后制成超薄切片，用透射电镜观察。
9. 抗菌物质胁迫下P. pentosaceus的蛋白质组学分析：将细菌在含和不含 0.8%（体积比）4 - 戊烯酸的 MRS 肉汤中培养 8 小时，离心收集细胞，进行平行反应监测分析验证蛋白质组学结果。
10. 统计分析：用 Student’s t检验分析两组青贮特性数据，使用 SPSS 22 软件进行统计，以P < 0.05 为差异显著。利用 Majorbio Cloud 平台对青贮微生物群和代谢物进行生物信息学分析。

结果

1. 接种P. pentosaceus后荨麻青贮的特性：萎蔫后荨麻的干物质含量为 37.56%，固化蛋白占干物质的 16.57%，WSC 占干物质的 7.49%，pH 为 7.23。发酵过程中，接种组（PP）在青贮 7 天后干物质含量低于对照组，7 天和 60 天后 pH 低于对照组，7 天后 LA 含量最高、AA 含量最低，30 天和 60 天后 AN 含量低于对照组。发酵 7 天后 4 - 戊烯酸含量高于其他发酵时间。
2. 接种P. pentosaceus后荨麻青贮细菌群落分析：在细菌 α 多样性分析中，对照组和处理组的 Shannon 和 Simpson 指数在 7 天和 30 天有显著差异。在门水平上，整个青贮过程中厚壁菌门（Firmicutes）占主导；在属水平上，气球菌属（Aerococcus）占主导，接种P. pentosaceus后，其相对丰度降低，而肠球菌属（Enterococcus）、不规则杆菌属（Irregularibacter）和片球菌属（Pediococcus）相对丰度增加。相关性分析表明，Enterococcus、Pediococcus和Weissella与 LA 呈显著正相关，与 pH 呈显著负相关；Irregularibacter和Clostridium_sensu_stricto_15与氨呈显著正相关，Enterococcus和Lactococcus与氨呈显著负相关。
3. 4 - 戊烯酸抑制P. pentosaceus生长的机制：在荨麻青贮过程中，Pediococcus与 4 - 戊烯酸等有机酸呈极显著负相关。4 - 戊烯酸和葡萄糖酸对P. pentosaceus的最小抑菌浓度分别为 16 mg/mL 和 32 mg/mL。随着 4 - 戊烯酸浓度增加，P. pentosaceus的吸光度显著降低，pH 升高。透射电镜结果显示，4 - 戊烯酸处理后P. pentosaceus细胞膜严重受损。

蛋白质组学分析表明，4 - 戊烯酸处理后，多数差异表达蛋白（DEPs）被注释到全局和概述图、碳水化合物代谢和翻译等途径。在糖酵解 / 糖异生途径中，6 个 DEPs 上调，2 个下调；丙酮酸代谢途径中，4 个上调，2 个下调；磷酸转移酶系统（PTS）途径中，7 个上调，2 个下调；脂肪酸代谢和生物合成途径中，3 个上调，3 个下调；核糖体途径中，4 个上调，26 个下调；同源重组途径中，13 个下调。

讨论

1. 接种P. pentosaceus的荨麻青贮特性：接种P. pentosaceus未改变发酵类型，但降低了青贮早期 AA 含量，减少了干物质损失。同时，接种降低了 AN 产量，可能是P. pentosaceus抑制了不良细菌活性。
2. 接种P. pentosaceus对荨麻青贮细菌群落的影响：接种P. pentosaceus增加了荨麻青贮细菌多样性，降低了Aerococcus和Atopostipes的相对丰度，增加了Enterococcus的相对丰度，抑制了Clostridium_sensu_stricto 15的生长，减少了氨的产生，且部分克服了 4 - 戊烯酸对Pediococcus活性的抑制。
3. 4 - 戊烯酸抑制P. pentosaceus生长的机制：4 - 戊烯酸在荨麻青贮自然发酵中存在且含量稳定，能抑制P. pentosaceus体外生长。其对核糖体途径相关蛋白表达影响较大，与乙酸相比，对P. pentosaceus的作用更强。
4. 差异表达蛋白的作用：在糖酵解 / 糖异生途径中，4 - 戊烯酸对P. pentosaceus能量代谢影响较大；在脂肪酸代谢和生物合成途径中，4 - 戊烯酸抑制脂肪酸合成，破坏细胞膜；在 PTS 途径中，P. pentosaceus通过增加相关蛋白表达，提高对 4 - 戊烯酸胁迫的耐受性；在核糖体途径中，4 - 戊烯酸影响核糖体完整性，降低P. pentosaceus对酸胁迫的耐受性。

结论

接种P. pentosaceus可降低荨麻青贮中氨的产生，但 4 - 戊烯酸的抗菌作用干扰了青贮品质的提升。4 - 戊烯酸主要通过抑制脂肪酸合成（fabG）和耐酸蛋白（accA）表达，破坏P. pentosaceus细胞壁。本研究为青贮发酵提供了新见解，为荨麻更好地青贮提供了新线索。