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植物细胞壁研究困难重重，为解决其功能特性难以在活体植物中以亚细胞分辨率成像的问题，研究人员开展 CarboTag 相关研究。结果显示，CarboTag 能实现多色成像及功能检测。这为植物细胞壁研究开辟新路径，助力深入探究其奥秘。
在植物的微观世界里，细胞壁宛如一座坚固的 “城堡”，守护着植物细胞，同时还承担着诸多重要使命。它不仅为细胞和组织提供机械支撑，像建筑物的承重墙一样维持着植物的形态；还参与细胞间的通讯交流，宛如一座信号枢纽，传递着各种关键信息；更是作为信号平台，在植物的整个生命周期中发挥着不可或缺的作用 。然而，这座 “城堡” 充满了神秘色彩，其复杂的结构和多样的功能让科学家们难以捉摸。由于细胞壁成分复杂，且目前缺乏有效的研究手段，导致许多关于细胞壁的特征仍是未解之谜，尤其是在活体植物中，想要以亚细胞分辨率来精准绘制其功能特性图，更是困难重重。这就好比在黑暗中摸索，难以看清真相。
为了揭开植物细胞壁的神秘面纱，来自荷兰瓦赫宁根大学和研究中心（Wageningen University and Research）实验室的研究人员展开了一场充满挑战的科研之旅。他们的研究成果发表在《Nature Methods》上，为植物细胞壁的研究带来了新的曙光。
研究人员开发了 CarboTag，这是一个模块化的工具盒，专门用于植物细胞壁的活体功能成像。它的核心是一种吡啶硼酸（pyridine boronic acid）小分子基序，就像一把精准的 “钥匙”，能够引导其携带的物质准确地到达植物细胞壁。基于 CarboTag，研究人员设计了一系列不同颜色的细胞壁成像探针，实现了多色成像，如同为细胞壁研究打造了一套绚丽多彩的 “画笔”。同时，他们还开发了新的功能报告基因，用于对细胞壁的关键特征进行活体定量成像，包括细胞壁孔隙度（network porosity）、细胞壁 pH 以及活性氧（ROS，reactive oxygen species）的存在情况。
在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先是化学合成技术，他们通过特定的化学反应合成了 CarboTag 及其相关探针 。其次是荧光显微镜成像技术，利用该技术对标记后的植物样本进行观察和分析，获取细胞壁的相关信息。此外，还运用了荧光寿命成像（FLIM，fluorescence lifetime imaging）技术，通过检测荧光寿命的变化来研究细胞壁的物理和化学性质。
下面来看看具体的研究结果。
CarboTag：研究人员从植物自身用于细胞壁结合的化学机制中获得灵感，以 4 - 吡啶基硼酸和炔丙基溴为原料，通过两步反应合成了 CarboTag。将 CarboTag 与 AlexaFluor488 融合得到的 CarboTag - AF488 探针，能在 30 分钟内对拟南芥（Arabidopsis thaliana）根细胞壁网络进行出色的染色，且能深入组织内部。与目前常用的细胞壁染色剂相比，CarboTag - AF488 渗透组织更快更有效，在 15 - 30 分钟内就能完全穿透根部，1 小时达到完全染色强度，而其他染色剂如 Calcofluor White（CFW）和 Renaissance SR2200 需要数小时，且渗透有限，还会产生细胞毒性。通过荧光漂白恢复（FRAP，fluorescence recovery after photobleaching）实验发现，CarboTag 与细胞壁的结合比 CFW 和 SR2200 更强。
多色植物细胞壁成像：CarboTag 可将任何携带叠氮基团且水溶性的荧光团转化为细胞壁染色剂。研究人员基于香豆素（AF430）、磺基罗丹明（AF488）和花青（sulfo - Cy3 和 sulfo - Cy5）等化学物质选择了不同颜色的探针，这些 CarboTag 融合物均能在 1 小时内对拟南芥幼苗根尖组织进行染色，且仅对细胞壁染色，无明显膜插入现象。CarboTag 适用于多种植物物种，包括绿藻、蕨类植物、苔藓和地钱等，还能对拟南芥种子周围富含果胶的黏液进行染色。此外，CarboTag 与现有的表达遗传编码荧光标记的植物品系兼容，可用于多重实时成像，也适用于高分辨率成像，如 AiryScan 成像。
细胞壁孔隙度：CarboTag - BDP：研究人员将 BDP（boron dipyrromethene）与 CarboTag 偶联得到 CarboTag - BDP 探针，该探针能清晰地定位到细胞壁。通过抑制纤维素合酶，改变细胞壁组成，发现处理后的植物细胞壁中 CarboTag - BDP 探针的荧光寿命显著增加，表明细胞壁孔隙度降低。对 FERONIA（fer）功能缺失突变体的研究发现，突变体的细胞壁孔隙度显著增加，且比野生型更不均匀，这与突变体的根生长表型相关。此外，CarboTag - BDP 还可用于研究其他植物组织的细胞壁孔隙度，如地钱的芽体和拟南芥叶片保卫细胞。
质外体 pH：CarboTag - OG：植物细胞生长与质外体 pH 密切相关，传统测量质外体 pH 的方法存在诸多缺陷。研究人员利用 CarboTag 构建了基于 FLIM 的质外体 pH 传感器 CarboTag - OG。在体外，其荧光寿命随 pH 变化呈现明显的 S 形变化。在拟南芥幼苗根中，FLIM 成像显示根伸长区的质外体 pH 低于根尖和成熟区，这与酸生长理论相符。用生长素（auxin）或壳梭孢菌素（fusicoccin）处理根后，质外体 pH 迅速降低，证明了 CarboTag - OG 可用于检测质外体 pH 的变化。
细胞壁中的 ROS 生成：CarboTag - Ox：ROS 在植物的生理过程中起着关键作用，但质外体中的 ROS 难以直接检测。研究人员将 BODIPY 581/591 C11 与 CarboTag 融合，并引入亲水间隔基团，得到 CarboTag - Ox 探针。该探针能定位到细胞壁，且在一定程度上减少了膜插入。用外源 ROS 或鞭毛蛋白肽 flg22 处理植物后，CarboTag - Ox 能实时监测细胞壁中 ROS 的动态变化。
研究结论表明，CarboTag 作为一种新型的细胞壁靶向分子基序，为植物细胞壁的活体功能成像提供了强大的工具。它具有快速渗透组织、低毒性、可构建多色探针和功能报告基因等优点，适用于多种植物物种和组织类型。然而，该技术也存在一些局限性，如染色所需的孵育时间受组织类型、植物物种和染料浓度影响，部分组织和物种染色困难；基于 FLIM 的报告基因对局部化学环境敏感，定量校准困难。尽管如此，CarboTag 的出现仍为植物细胞壁的研究开辟了新的道路，未来有望进一步拓展其应用范围，深入探究植物细胞壁的奥秘，为植物学研究和农业生产提供重要的理论支持。
