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本文聚焦海绵与共生微生物关系，通过 16S rRNA 基因分析，研究 5 种雌雄异体海绵在生殖与非生殖期微生物组成差异。发现部分海绵在配子发生早期，微生物组成改变，古菌门 Nitrososphaeria 起关键作用，为理解海绵生殖生物学提供新视角。
研究背景
地球上所有动物都与环境微生物相互作用，形成从良性到致病的复杂共生关系。微生物能显著影响宿主生物学和物种形成，自然选择可能在全基因组水平起作用。生殖微生物组（reproductive microbiome）对宿主生育和适应性有重要影响，但在野生动物尤其是无脊椎动物中研究较少。
海绵是具有突出且多样共生关系的水生动物，其微生物在营养获取、化学防御和宿主生理方面发挥重要作用。然而，海绵微生物在生殖过程中的功能虽有假设，但很少得到证实。本研究旨在探究 5 种雌雄异体海绵在有性生殖期的微生物组成，分析生殖与非生殖个体微生物组的变化，并将这些变化与配子发生阶段相关联。
材料和方法
- 样本采集、DNA 提取和 16S rRNA 基因扩增：从 5 种海绵中收集 106 个标本，包括 4 种高微生物丰度（HMA）海绵和 1 种低微生物丰度（LMA）海绵。样本采集自不同地点和时间，采集后采用双重保存方法。使用 Dneasy Blood and Tissue kit 提取 DNA，扩增 16S rRNA 基因 V4 区域，进行测序。
- 生殖状态评估：用福尔马林固定的样本评估海绵个体的生殖状态和配子发生阶段。对有硅质骨针的样本进行脱硅处理，然后分别进行光镜和透射电镜（TEM）观察。光镜样本经脱水、包埋、切片和染色后观察；TEM 样本经固定、脱水、包埋后制作超薄切片观察。
- 微生物组分析流程：对原始 16S rRNA 基因序列进行处理，去除引物序列，合并配对读数，进行质量检查、去重、降噪和分类学注释。生成的 ZOTU 表经稀有化处理后，用于 alpha 多样性分析和 beta 多样性分析。
- 微生物组统计分析：在 R 语言中使用 vegan 包进行微生物群落的距离多元分析。计算 Bray-Curtis 相异距离矩阵，进行聚类分析和主坐标分析（PCoA）。用非参数置换多元方差分析（PERMANOVA）检验宿主身份和生殖状态对微生物群落的影响，用广义线性模型分析特定 ZOTU 丰度的变化。
- 宿主差异基因表达分析：利用已有研究的参考转录组和原始读数，对 Geodia macandrewii 进行差异基因表达分析。使用 RSEM 评估映射读数丰度，用 edgeR 寻找差异表达基因，进行注释和基因本体（GO）富集分析。
研究结果
- 生殖阶段评估：各群体中 40%-67% 的个体参与生殖，部分雌性个体有不同发育阶段的卵母细胞，部分个体有精子。TEM 观察发现，在 Geodia macandrewii、Petrosia ficiformis 和 Chondrosia reniformis 的生殖标本中，存在微生物细胞的吞噬现象，用于形成卵黄小板。
- 海绵微生物群落的分类组成和排序：在 106 个样本中鉴定出 3829 个 ZOTU，属于 37 个原核生物门和 75 个类。Nitrososphaeria 是最丰富的类。宿主身份是影响海绵微生物组结构的主要因素，HMA 和 LMA 物种的微生物组有明显差异。地理位置也影响微生物群落，不同物种的 alpha 多样性值差异显著。
- 生殖状态对海绵微生物多样性和组成的影响：多数物种中，生殖与非生殖个体的 alpha 多样性和样本离散度无显著差异。但在 Petrosia ficiformis 和 Geodia macandrewii 中，生殖状态影响微生物组组成，样本在 PCoA 轴上有明显分离。
- 差异丰度分析：不同物种中，生殖与非生殖个体的差异丰度 ZOTU 数量不同。在 Geodia macandrewii 和 Petrosia ficiformis（Naples）中，有大量差异丰度 ZOTU，主要与 Nitrososphaerota 门相关。
- 差异丰度最高的 ZOTU 的系统发育：Geodia macandrewii 和 Petrosia ficiformis 中，差异丰度最高的 ZOTU 大多属于 Nitrososphaerota 门和 Nitrososphaeria 类，它们在系统发育树上聚类在不同分支。
- Geodia macandrewii 的差异基因表达：Geodia macandrewii 生殖与非生殖个体有 345 个差异表达转录本。生殖个体中，与有丝分裂增殖和免疫反应相关的基因上调；非生殖个体中，与核糖体生成和代谢途径相关的基因上调。
讨论
- 海绵生殖过程中微生物组的动态变化：多数研究的海绵在生殖期微生物组稳定，但有早期卵母细胞（前卵黄发生期）的海绵，生殖与非生殖个体的微生物组有显著差异。Nitrososphaeria 类在这些差异中起重要作用，其部分成员可能参与海绵生殖，且可能垂直传播。
- 微生物组在配子发生中的作用：微生物可能有多种作用。一是满足卵母细胞发育的高能量需求，海绵可能选择性吞噬特定微生物获取营养，但吞噬是否具有选择性有待证实。二是触发卵母细胞发生，类似其他动物中微生物对生殖的促进作用。三是增强后代适应性和发育，如为宿主提供特定氨基酸或参与发育过程。
- 海绵配子发生阶段的微生物动态：HMA 海绵的微生物可能支持生殖过程，不同物种的配子发生时间和营养需求不同，配子发生阶段也影响营养需求。有前卵黄发生期卵母细胞的海绵，微生物组变化最大，可能与该阶段的高能量需求有关。
- 微生物组水平的性别特异性差异：海绵微生物组的性别特异性差异研究较少，本研究虽样本量有限，但发现 Geodia macandrewii 中存在与雄性或雌性相关的差异丰度 ZOTU。其他动物中也存在微生物组的性别特异性差异，可能与生理需求或栖息地选择有关。
- 海绵免疫调节生殖微生物组：海绵的先天免疫系统在调节微生物组中起关键作用。Geodia macandrewii 在生殖过程中，多种先天免疫基因上调，可能参与识别和吞噬共生微生物，以增强营养或维持微生物组平衡。
结论
海绵宿主的营养需求和免疫系统之间的复杂相互作用影响生殖过程中微生物组的组成。古菌门 Nitrososphaeria 可能在卵黄生成过程中为宿主提供营养，但具体机制尚不清楚。研究结果表明宿主的性系统对微生物群有重要影响，评估海绵的性别和生殖状态对理解海绵 - 微生物共生关系的进化和生态轨迹至关重要。
