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在基因治疗中，DNA 载体的质量和稳定性至关重要。研究人员针对传统质粒 DNA 的不足，开展了 ministring DNA（msDNA）稳定性的研究。结果发现 msDNA 稳定性更强，还优化了其冻干方法。这为基因治疗提供了更安全有效的载体选择。
基因治疗近年来发展迅速，在对抗新冠疫情中，mRNA-LNP 疫苗的成功应用更是凸显了核酸疫苗的潜力。在基因治疗众多方式里，DNA 载体十分关键，它既可以作为活性药物成分，也能作为生产病毒载体和 RNA 的起始材料。然而，目前常用的质粒 DNA 存在不少问题，比如免疫原性高，其中含有的原核 DNA 序列，像免疫刺激的 CpG 基序、细菌复制起点和抗生素抗性盒等，会引发免疫反应；而且还存在插入诱变风险，可能导致有害的基因整合。同时，DNA 载体的稳定性也影响着治疗效果，不稳定的 DNA 容易被核酸酶降解，降低治疗产品质量，引发安全问题 。为了解决这些问题，来自加拿大 Mediphage Bioceuticals 和滑铁卢大学药学院的研究人员，对一种新型的线性共价闭合（LCC）双链 DNA 分子 ——ministring DNA（msDNA）展开了研究，相关成果发表在《Scientific Reports》上。
研究人员主要运用了琼脂糖凝胶电泳（AGE）、超高效液相色谱（UHPLC）、超声处理以及冻干等技术。通过 AGE 和 UHPLC 分析 msDNA 在不同条件下的稳定性；利用超声处理模拟机械应力，探究 msDNA 和传统质粒 DNA（pDNA）对机械应力的耐受性差异；将 msDNA 和 pDNA 在不同 pH 缓冲液中孵育，并用 T5 - 核酸外切酶（T5-exo）处理，结合 AGE 分析其对化学应力的稳定性；还通过冻干实验，研究不同条件对 msDNA 冻干稳定性的影响 。
研究结果如下：
- msDNA 在水溶液中具有稳定性：通过 AGE 和 UHPLC 分析发现，msDNA（Construct M）在室温下至少可稳定保存 1 个月，在 4°C 下可稳定保存 3 个月。
- msDNA 对机械应力稳定性更强：对比 msDNA 和 pDNA 在弱（30 - 45 瓦 / 升）、强（100,000 瓦 / 升）超声处理下的稳定性，结果显示 msDNA 在弱超声处理较长时间（约 30s）仍能保持稳定，而 pDNA 出现降解；在强超声处理较短时间（5 - 10s）时，msDNA 的存活率也高于 pDNA。
- msDNA 对化学应力稳定性更优：将 msDNA 和 pDNA 在 pH 3 - 10.5 的缓冲液中孵育，并用 T5-exo 处理后分析。结果表明，在 pH 4 时，msDNA 能保持稳定，而超螺旋 pDNA 大部分受损，这对基于可电离脂质的脂质纳米颗粒（LNP）配方意义重大。
- 冻干可提高 msDNA 稳定性：
- 初步测试：对不同 msDNA 构建体在不同规模下进行冻干实验，发现无添加剂时，msDNA 冻干后不稳定，且较大的 DNA 分子更易受损，但冻干规模增大时稳定性有所提高。
- DNA 形式和冻干过程的影响：用不同盐溶液处理 DNA 后冻干，发现用盐酸胍处理的样本冻干后损伤小，而用硫酸铵处理的样本损伤大，这表明 DNA 制造过程中的处理会影响其冻干稳定性。
- 添加赋形剂改善冻干效果：添加葡萄糖和海藻糖后，msDNA 冻干稳定性显著提高，由于海藻糖具有更多优势，选择其进一步研究。结果显示，海藻糖能普遍增强不同 msDNA 构建体的稳定性，且不影响其生物学活性。
- 冻干产品的长期稳定性：对含有 10 mM 海藻糖的冻干 msDNA 样本（Construct A）进行长期稳定性研究，发现冻干样本在室温下可稳定保存至少 4 周，而溶液状态样本在室温下 4 周后出现显著 DNA 损伤 。
研究结论和讨论部分指出，msDNA 因其线性、无扭转的结构，在化学和机械应力下稳定性增强，在 pH 4 时的稳定性对 LNP 应用意义非凡，能减少 DNA - LNP 配方的变异性，提高非病毒基因递送系统的有效性。冻干技术结合海藻糖作为赋形剂，解决了当前基因药物冷链储存的难题，使 msDNA 能在室温下保存和运输，扩大了基因疗法的可及性。此外，msDNA 在大肠杆菌中制造，利用了大肠杆菌的错配修复（MMR）系统，保证了高保真度的 DNA 产品，有望成为多种基因治疗应用的通用 DNA 载体。但不同 msDNA 构建体的冻干后稳定性可能因大小和遗传元件不同而存在差异，未来还需对每个构建体单独评估。这项研究为基因治疗提供了一种更安全、有效的 DNA 载体选择，推动了基因治疗领域的发展 。
