β-胡萝卜素优化Tris稀释剂对湖羊精液冷冻保存效果及抗氧化机制研究

本研究针对湖羊精液冷冻保存过程中氧化应激损伤导致精子质量下降的问题，通过向Tris稀释剂中添加不同浓度β-胡萝卜素（0-40 mg/L），系统评估其对冷冻后精子运动参数（TM、PM、MAD）、膜/顶体完整性、氧化应激指标（ROS、MDA、T-AOC、SOD、CAT）、线粒体膜电位（MMP）及凋亡率的影响。研究发现20 mg/L β-胡萝卜素能显著提升精子抗氧化能力，降低TBHP诱导的氧化损伤，为优化家畜精液冷冻保存技术提供新策略。

　　

在畜牧业发展中，精液冷冻保存技术是保障优质种质资源长期保存和跨时空利用的关键。然而冷冻过程中产生的活性氧（ROS）会攻击精子膜脂质，导致运动能力下降、DNA损伤甚至细胞凋亡。湖羊作为我国重要畜种，其精液冷冻效果直接影响人工授精成功率。传统Tris稀释剂虽能维持基本冷冻需求，但对抗氧化保护仍有不足。

为解决这一难题，江苏省现代农业产业技术体系建设项目支持的研究团队在《Cryobiology》发表论文，首次系统评估β-胡萝卜素在湖羊精液冷冻中的应用价值。β-胡萝卜素作为维生素A前体，其分子结构中的共轭双键能有效淬灭单线态氧，但此前未见其在反刍动物精液冷冻中的研究报道。

研究采用五项关键技术：1）计算机辅助精子分析（CASA）定量运动参数（TM、PM、VCL等）；2）流式细胞术检测膜完整性（PI染色）和顶体状态（FITC-PSA）；3）荧光探针法测定线粒体膜电位（JC-1染色）和ROS水平（DCFH-DA）；4）比色法检测氧化应激标志物（MDA、SOD、CAT、T-AOC）；5）Western blot分析细胞色素C（Cytochrome C）表达。实验设置空白对照、β-胡萝卜素梯度组（10-40 mg/L）及TBHP氧化应激模型组。

Effect of β-Carotene for sperm motility parameters and biokinetic characteristics after cryopreservation
数据显示20 mg/L组总运动力（TM）达68.5%，显著高于对照组52.3%（P<0.05），且平均运动度（MAD）提升37%。但40 mg/L组出现剂量依赖性下降，提示高浓度可能产生细胞毒性。

Membrane and acrosome integrity
20 mg/L组膜完整率（76.2% vs 对照组58.7%）和顶体完整率（82.4% vs 64.9%）均显著改善（P<0.05），电镜观察证实其能维持质膜脂双层有序排列。

Oxidative stress parameters
在TBHP模型中，20 mg/L组使ROS降低41.8%，MDA含量下降53.6%，同时T-AOC提升2.1倍，SOD和CAT活性分别提高68%和72%（P<0.05）。

Mitochondrial function and apoptosis
JC-1检测显示20 mg/L组高膜电位精子比例（63.5%）显著高于TBHP组（38.2%），细胞色素C释放量减少64%，凋亡率从28.7%降至12.4%（P<0.05）。

讨论与结论
研究揭示β-胡萝卜素通过三重机制发挥作用：1）直接清除ROS，阻断脂质过氧化链式反应；2）激活内源性抗氧化酶系（SOD/CAT）；3）稳定线粒体嵴结构，减少凋亡信号释放。20 mg/L的优化浓度使解冻后精子质量达到人工授精标准（PM>40%），且成本效益比显著优于维生素E等传统抗氧化剂。该成果为开发新型家畜精液冷冻保护剂提供理论依据，对推动绵羊遗传资源保存和品种改良具有重要实践价值。未来研究可进一步探索β-胡萝卜素与卵黄协同作用的分子机制。