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在氧化应激相关研究中，确定蛋白质氧化状态变化对其功能及生理、疾病进程的影响存在挑战。研究人员利用固定化苯胂氧化物（PAO-Sepharose）研究心脏样本中候选蛋白硫醇氧化状态，发现 APIP 和 GGCT 在体内氧化应激模型中氧化，该方法为相关研究提供有效工具。
在生命活动的舞台上，细胞时刻都在进行着复杂而微妙的氧化还原反应。心脏作为人体至关重要的器官，其细胞在健康与疾病状态下都会产生各类氧化剂。这些氧化剂不仅与动脉粥样硬化、缺血再灌注损伤、高血压等多种心血管疾病紧密相连，同时也在心肌收缩功能调节以及抵抗梗死等过程中发挥着重要作用。然而，目前在氧化应激相关研究领域，仍存在诸多难题。一方面，尽管已识别出大量可能受半胱氨酸氧化还原调控的蛋白质，但它们的功能后果以及对健康和疾病的潜在影响往往并不明确。另一方面，现有的分析蛋白质硫醇氧化状态的方法，如基于质谱的复杂标记和分析技术，不仅资源消耗大、耗时久，而且在分析多种复杂生物组织样本时也面临挑战，这使得进一步探究目标蛋白的氧化还原状态变得困难重重。
为了解开这些谜团，来自英国伦敦玛丽女王大学威廉哈维研究所（William Harvey Research Institute, Queen Mary University of London）、英国帝国理工学院国家心肺研究所（National Heart and Lung Institute, Imperial College London）以及美国罗格斯新泽西医学院细胞生物学与分子医学系（Department of Cell Biology and Molecular Medicine, Rutgers New Jersey Medical School）的研究人员携手开展了一项意义重大的研究。他们的研究成果发表在《Scientific Reports》上，为该领域带来了新的曙光。
研究人员在本次研究中运用了多种关键技术方法。在动物实验方面，选用了不同周龄的雄性 C57BL/6J 小鼠和转基因小鼠，构建了内毒素血症（通过给小鼠腹腔注射脂多糖 LPS）和 1 型糖尿病（通过给小鼠腹腔注射链脲佐菌素 STZ）的小鼠模型 。在蛋白分析技术上，利用固定化苯胂氧化物（PAO-Sepharose）亲和捕获技术结合液相色谱 - 串联质谱（LC-MS/MS），对心脏样本中蛋白质的氧化状态进行检测和分析；同时，借助免疫沉淀和蛋白质免疫印迹（Western blot）技术，进一步验证和定量目标蛋白的氧化水平。
下面来看具体的研究结果：
- 心脏中存在氧化感应蛋白：研究人员对离体心脏进行逆行灌注，分别设置对照组（仅用 Krebs 缓冲液灌注）和氧化剂处理组（用含过氧化氢或二酰胺的 Krebs 缓冲液灌注），之后制备可溶性蛋白组分并应用于 PAO-Sepharose 进行蛋白捕获，再通过 LC-MS/MS 技术对捕获的蛋白进行鉴定和定量。火山图分析显示，与对照组相比，过氧化氢或二酰胺处理组中分别有 143 或 125 种蛋白的捕获量显著降低（P<0.05） ，这表明这些蛋白可能发生了氧化，转变为二硫键状态，从而不再与 PAO-Sepharose 结合。在互补实验中，研究人员使用转基因 FLAG-Trx1C35S-HA 小鼠的离体心脏进行灌注实验，同样设置对照组和氧化剂处理组，通过抗 FLAG 亲和琼脂糖免疫捕获 FLAG-Trx1 - 底物复合物，经 Western blot 检测发现，氧化剂处理组出现了更多条带。LC-MS/MS 分析结果表明，与对照组相比，过氧化氢或二酰胺处理组中分别有 83 或 229 种蛋白的捕获量显著增加（P<0.05） ，这些蛋白可能是 Trx1 的二硫键相互作用伙伴，在氧化处理后被 “捕获”。
- 两种方法鉴定出已确立的半胱氨酸氧化还原调节蛋白：研究人员在 PAO-Sepharose 数据集和转基因 Trx1 心脏的蛋白质组学列表中，分别寻找已知的具有反应性半胱氨酸的蛋白和与 Trx1 通过二硫键形成相互作用的蛋白。结果发现，酪氨酸蛋白磷酸酶非受体型 11 和无菌 α 基序和组氨酸 - 天冬氨酸结构域包含蛋白 1，这两种已知受半胱氨酸氧化调节的蛋白，在两个氧化剂处理组（对照组与过氧化氢组、对照组与二酰胺组）中均被鉴定出来；同时，过氧化物还原酶 1（Peroxiredoxin 1）、线粒体肽甲硫氨酸亚砜还原酶和磷酸丙糖异构酶等已知与 Trx1 相互作用的蛋白也在相应实验中被识别。这些结果有力地支持了实验方法在鉴定氧化还原活性半胱氨酸蛋白方面的有效性。
- 氧化应激病理生理模型中氧化还原敏感蛋白的调节：为了探究 PAO-Sepharose 在体内氧化条件下分析样本的适用性，研究人员利用 LPS 诱导小鼠内毒素血症，用 STZ 诱导小鼠 1 型糖尿病。通过 ELISA 检测发现，LPS 处理后小鼠血浆中 IL-1β 水平显著升高（P<0.0001） ；通过血糖仪检测发现，STZ 处理后小鼠非空腹血糖水平显著升高（P<0.0001） ，这表明两种疾病模型构建成功。对这些小鼠心脏的可溶性组分进行 PAO-Sepharose 柱亲和捕获，并用蛋白质特异性抗体进行免疫印迹定量分析，结果显示，凋亡蛋白酶激活因子 1 相互作用蛋白（APIP）和 γ- 谷氨酰环转移酶（GGCT）在 LPS 或 STZ 处理组中的捕获量显著低于对照组（APIP：LPS 处理组 P=0.0002，STZ 处理组 P=0.0471；GGCT：LPS 处理组 P=0.0073，STZ 处理组 P=0.0009） ，这表明这两种蛋白在体内氧化应激条件下更易被氧化。而肌钙蛋白 I 相互作用激酶（TNNI3K）、磷酸化酶 b 激酶 γ（PHKG1）和 NIMA 相关激酶 7（Nek7）在 LPS 或 STZ 处理后，其氧化还原状态未发生显著改变。
研究结论和讨论部分指出，本研究提供了两种蛋白质组学方法来深入探究心脏中氧化还原调节蛋白。PAO-Sepharose 方法能够特异性结合还原状态的相邻硫醇，通过比较正常和氧化条件下蛋白捕获量的差异，筛选出潜在的硫醇氧化还原调节蛋白；而基于 Trx1C35S的 “底物捕获” 方法，则可以在细胞内环境中识别与 Trx1 相互作用增加的氧化蛋白。尽管这两种方法都存在一定的局限性，如 PAO-Sepharose 捕获仅针对心脏组织的可溶性部分，样本制备过程中可能存在硫醇的自动氧化，且无法确定与 PAO 结合的反应性半胱氨酸残基位点；“底物捕获” 方法则需要构建和维护转基因小鼠。但它们相互补充，成功鉴定出了在体内氧化应激条件下发生氧化的蛋白，如 APIP 和 GGCT。这不仅为氧化应激相关疾病的发病机制研究提供了新的视角，也为后续开发针对性的治疗策略奠定了重要基础，让我们在理解心脏氧化还原生物学以及相关疾病的道路上迈出了重要一步。
