EXO1：减数分裂重组奥秘的关键 “拼图”—— 调控 MLH1-MLH3 内切酶的分子机制解析

在减数分裂重组研究中，MLH1-MLH3（MutLγ）内切酶活性调控机制不明，尤其是 EXO1 的作用。研究人员开展 EXO1 对 MutLγ 内切酶激活作用的研究，发现 EXO1 通过与 MutSγ、MutLγ 和 dsDNA 相互作用促进切割，为理解减数分裂重组提供依据。

　　减数分裂是真核生物产生配子的关键过程，如同一场精密的遗传 “舞蹈”。在这个过程中，同源染色体进行配对、交换遗传物质，为后代带来丰富的遗传多样性。其中，减数分裂重组中间体的精确处理至关重要，尤其是通过 MLH1-MLH3（MutLγ）内切酶将其转化为交叉互换（crossover），这一过程影响着染色体的正确分离和遗传物质的稳定传递 。然而，长期以来，MutLγ 内切酶活性的调控机制一直是个未解之谜，特别是 EXO1 在这一过程中的作用，如同隐藏在迷雾中的宝藏，亟待挖掘。这不仅关系到我们对减数分裂基本生物学过程的深入理解，还与某些因减数分裂异常导致的不育症等健康问题紧密相关。因此，探索 EXO1 在减数分裂重组中的具体功能和作用机制，成为生命科学领域的重要研究方向。

来自瑞士意大利语区大学（Università della Svizzera italiana，USI）生物医学科学学院的研究人员，针对这一科学问题展开了深入研究。他们发现，EXO1 通过与 MLH1、MSH4 以及 DNA 的保守相互作用，促进了 MutLγ 内切酶的活性，这一发现为揭示减数分裂重组的分子机制提供了关键线索，对理解减数分裂异常相关疾病的发病机制具有重要意义。该研究成果发表在《Nature Communications》杂志上。

研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：一是利用蛋白质纯化技术，从昆虫细胞中纯化出 MutLγ、MutSγ、EXO1 和 RFC 等多种重组蛋白；二是采用 DNA nicking assays 和 exonuclease assays 等核酸酶活性检测实验，来评估 MutLγ 的内切酶活性以及 EXO1 的核酸外切酶活性；三是借助 AlphaFold2 进行结构建模，预测蛋白质之间的相互作用位点 。

研究结果

1. EXO1 刺激 MutLγ 依赖 MutSγ 的存在：研究人员通过 DNA nicking assays，以负超螺旋双链 DNA（dsDNA）为底物，利用纯化的人重组蛋白进行实验。结果发现，在低金属离子浓度（0.3 - 1 mM Mn²⁺或 Mg²⁺）下，EXO1（D173A）能显著刺激 MutSγ-MutLγ 的内切酶活性，最高可达约 5 倍。并且，EXO1（D173A）刺激 MutLγ 的内切酶活性仅在 MutSγ 存在时才会发生，这揭示了 MutSγ 和 EXO1 之间存在着未被探索的相互作用。
2. EXO1 与 MutLγ 的物理相互作用对其激活作用贡献有限：通过构建人 EXO1（D173A）的 MIP 基序（F506A 和 F507A）以及 I403E 等突变体，并进行蛋白质相互作用和内切酶活性检测实验。结果显示，MIP 基序突变对 EXO1 与 MutLγ 的物理相互作用影响不显著，对 MutLγ 内切酶活性也无明显影响，即使 I403E 突变与 MIP 基序突变联合，对 DNA 切割的抑制作用也不具有统计学意义。这表明 MLH1-EXO1 界面的完整性对 MutLγ 内切酶活性部分可缺失，暗示在 MutSγ-MutLγ-EXO1 复合物中可能存在其他重要界面。
3. EXO1 与 MutSγ 直接物理相互作用：运用 pulldown 实验和 mass photometry 等技术，研究人员发现人 EXO1（D173A）与 MutSγ 能直接发生物理相互作用，且该相互作用不受 MutLγ 的影响。而酵母 Exo1 与酵母 MutSγ 在相同实验条件下的相互作用几乎检测不到，说明这种相互作用在单细胞真核生物中可能不保守。
4. EXO1 的 353 - 390 区域对 MutSγ-MutLγ 激活至关重要：构建一系列 EXO1 截断突变体并进行功能检测实验，结果表明，截断 EXO1 的 C 末端至 390 位残基时，对 MutSγ-MutLγ 的内切酶活性影响较小；但截断至 352 位残基时，几乎完全丧失对 MutSγ-MutLγ 的刺激能力。同时，该区域缺失不影响 EXO1 的核酸酶活性，表明 EXO1 的这两种功能在遗传上是可分离的。
5. EXO1 的 W371 残基对刺激 MutSγ-MutLγ 不可或缺：通过构建 EXO1 的 W371E、Y375E 等点突变体，研究发现 W371E 突变完全消除了 EXO1 刺激 MutSγ-MutLγ 的能力，而对 EXO1 的核酸酶活性和 DNA 结合能力无影响，确定 W371 是刺激 MutSγ-MutLγ 的关键残基。
6. EXO1 与 MSH4 的相互作用促进 MutLγ 内切酶活性：AlphaFold2 模型预测 EXO1 的保守簇与 MSH4 的 N 末端区域相互作用，通过构建 MSH4 的点突变体进行实验，结果显示，MSH4 的 T238E、Y244D、F288E 三重突变显著损害了 MutLγ 在 EXO1（D173A）存在时的内切酶活性，且减弱了与 EXO1 的物理相互作用，证明了 EXO1 与 MSH4 的保守物理相互作用对刺激 MutLγ 内切酶活性的必要性。
7. EXO1 的 DNA 结合促进 MutSγ-MutLγ 的激活：构建 EXO1 的 D78A（破坏核酸酶活性）和 K185D、K237D（破坏 DNA 结合活性）等突变体，实验表明，D78A 突变对刺激 MutSγ-MutLγ 无影响，而 K185D、K237D 突变显著降低了 EXO1 刺激 MutSγ-MutLγ 的能力，说明 EXO1 的 DNA 结合活性对刺激 MutSγ-MutLγ 的核酸酶活性至关重要，而其金属配位残基对该活性并非必需。

研究结论与讨论

该研究通过一系列生化实验和结构建模分析，明确了 EXO1 在激活减数分裂 MutLγ 内切酶复合物中的重要作用机制。EXO1 通过与 MutSγ、MutLγ 和 dsDNA 的相互作用，作为减数分裂解旋酶复合物的一个结构组分，促进了 MutLγ 对 DNA 的切割，最终实现减数分裂重组中间体向交叉互换的转化。这一发现不仅填补了我们对减数分裂重组分子机制认识的空白，还为深入理解某些因减数分裂重组因子突变导致的不育症等疾病的发病机制提供了理论基础，具有重要的生物学意义和潜在的临床应用价值 。未来，有望基于这些发现开发新的诊断和治疗策略，为相关疾病的防治带来新的希望。