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这篇研究聚焦低级别骨肉瘤（LGOS）。通过对 15 例 MDM2 扩增的 LGOS 及 46 例其他骨肿瘤研究发现，LGOS 中 GLI1 扩增常见，还存在 GLI1 融合。此研究为 LGOS 及相关肿瘤提供新见解，助力肿瘤研究与诊疗。
研究背景
胶质瘤相关癌基因同源物 1（Glioma-associated oncogene homologue 1，GLI1）基因位于 12q13 - 15 染色体区域，该区域还包含小鼠双微体 2（mouse double minute 2，MDM2）、细胞周期蛋白依赖性激酶 4（cyclin-dependent kinase 4，CDK4）等重要癌基因。在一些间充质肿瘤和分化良好 / 去分化脂肪肉瘤中，GLI1 会与 MDM2 等基因共同扩增 。低级别骨肉瘤（low-grade osteosarcoma，LGOS）是一种低级别的恶性成骨性肿瘤，MDM2 在 LGOS 中也会发生扩增，但此前 LGOS 中 GLI1 扩增 / 融合的情况尚未被探究。
材料和方法
- 样本选取：研究遵循当地伦理标准，选取 15 例 MDM2 扩增的 LGOS 肿瘤样本，以及 46 例其他各类骨肿瘤和肿瘤样病变样本。这些样本均来自首都医科大学附属北京积水潭医院病理科档案。
- 检测方法
- 荧光原位杂交（FISH）分析：使用市售的 GLI1 和 MDM2 扩增探针、GLI1 双色断裂探针，按标准程序操作，用荧光显微镜和成像系统分析样本。
- DNA 测序和数据分析：从肿瘤样本中提取 DNA，用捕获式靶向测序 panel 对 520 个癌症相关基因进行检测，之后进行测序数据的比对、变异检测和注释等分析。
- RNA 测序和数据分析：从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本中提取 RNA，检测其质量和数量后进行一系列操作构建测序文库，在测序系统上测序并分析数据，以检测基因融合和可变剪接事件。
- 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和桑格测序（Sanger sequencing）：样本送至专业认证实验室，设计引物进行 RT-PCR，产物经 Sanger 测序，用 BLAST 分析测序数据。
研究结果
- LGOS 的临床病理特征：15 例 LGOS 病例包括 10 例骨旁骨肉瘤（parosteal osteosarcoma，POS）和 5 例低级别中央骨肉瘤（low-grade central osteosarcoma，LGCOS）。患者年龄 13 - 56 岁，平均 30 岁，中位 27 岁，男性 9 例，女性 6 例。肿瘤多位于股骨，其次是胫骨等。POS 呈外生性肿瘤，LGCOS 多位于骨髓腔。显微镜下，两者均由成纤维细胞样梭形肿瘤细胞和骨小梁组成，部分有低级别软骨成分，部分病例出现去分化成分。15 例患者除 1 例初诊时已有肺转移外均接受原发肿瘤手术，部分患者术后化疗，随访发现部分病例复发或转移，患者均带瘤生存。
- FISH 结果：15 例 LGOS 病例中，13 例（87%）检测到 GLI1 扩增，2 例阴性；所有 LGOS 病例均有 MDM2 扩增；15 例 LGOS 病例中均未检测到 GLI1 融合；46 例其他骨肿瘤和肿瘤样病变样本均无 GLI1 扩增和融合。
- 下一代测序（NGS）结果：对 6 例 LGOS 病例进行 NGS 检测，发现所有病例均有 GLI1 扩增，且伴有 CDK4、MDM2 等基因扩增；在病例 3 中还发现了蛋白磷酸酶 1H（PPM1H）外显子 6 与 GLI1 外显子 2 的基因融合（PPM1H::GLI1），经 RT-PCR 和 Sanger 测序证实。
讨论
GLI1 基因编码锌指转录因子，是多种肿瘤发生信号通路的下游效应器，激活 GLI1 癌基因在声波刺猬（sonic hedgehog，SHH）信号通路中很重要，靶向 SHH - GLI 通路被视为多种恶性肿瘤的潜在治疗方法。本研究中 87% 的 LGOS 病例有 GLI1 扩增，6 例有 CDK4/MDM2/GLI1 共扩增，1 例同时存在 GLI1 扩增和重排，这是首次在 LGOS 肿瘤样本中报道 CDK4/MDM2/GLI1 共扩增。12q13 - 15 染色体区域基因扩增虽对某些肿瘤诊断有提示作用，但仅靠基因扩增不能确诊，还需结合多种检查结果。
研究发现，GLI1 基因改变和表达会赋予肿瘤独特形态特征，但本次研究中 15 例 MDM2 扩增的 LGOS 病例未发现与 GLI1 改变的间充质肿瘤相同的形态，可能与病例数少有关。在 MDM2 扩增的 LGOS 中，可能存在与分化良好 / 去分化脂肪肉瘤类似的复杂融合事件，PPM1H::GLI1 融合可能由此产生，但其对 LGOS 致癌行为的影响需进一步研究。PPM1H 是金属依赖性丝氨酸 / 苏氨酸蛋白磷酸酶 PPM 家族成员，在多种癌症研究中，其在肿瘤发生和进展中的作用存在争议，本次是首次报道 PPM1H 在 LGOS 中的改变，其在 LGOS 发生发展中的作用有待深入研究 。本研究首次报道 LGOS 中存在 PPM1H::GLI1 融合和 CDK4/MDM2/GLI1 共扩增，为 LGOS 及相关肿瘤研究提供了新视角。
