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这篇研究发现苏氨酸（Threonine）对部分蓝藻有毒性。通过多组学分析及实验，揭示 ThrC 兼具苏氨酸合酶和脱氨酶的兼职功能，其在高苏氨酸条件下产生的 α- 酮丁酸（aKB）等导致细胞死亡。研究为理解营养敏感型细菌死亡机制提供了新视角。
引言
在营养丰富的实验室环境中，生长缓慢的细菌，如铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）、水生栖热菌（Aquifex aeolicus）等，常面临生存挑战。这些细菌缺乏精细调节的营养摄取系统，特定营养物质过量可能对其细胞有毒性，但具体机制尚不清楚。
天冬氨酸作为苏氨酸（Threonine）、异亮氨酸和蛋氨酸生物合成的起始原料，在细菌代谢中起着关键作用。Threonine 在细菌细胞中主要参与翻译过程，但多余的 Threonine 需通过多种降解系统进行循环利用，如脱氨、脱氢和醛缩酶反应等。Threonine 代谢平衡至关重要，失衡会对细胞产生致命影响。
苏氨酸合酶（ThrC）是一种依赖磷酸吡哆醛（PLP）的酶，可催化 O - 磷酸 - L - 高丝氨酸（OPHS）转化为 L-Threonine，该功能在细菌、酵母和植物中具有进化保守性。有趣的是，一些生物中的 ThrC 或相关酶具有双功能，如嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）HB8 中的 ThrC 既能合成 Threonine，又能将其降解为 α- 酮丁酸（aKB）。本研究聚焦于 Threonine 对淡水细菌，尤其是铜绿微囊藻的毒性机制，旨在揭示其中的分子机制，为理解细菌对环境刺激的反应提供新视角。
结果
- 苏氨酸引发蓝藻死亡的过程
添加蛋氨酸或丙氨酸能有效缓解 Threonine 对铜绿微囊藻的毒性，这表明 Threonine 诱导的细胞死亡可能与相关氨基酸代谢途径的相互作用有关，而非营养转运体的竞争抑制或细胞膜的直接破坏。
转录组分析显示，Threonine 处理导致铜绿微囊藻中多个氨基酸代谢途径下调，包括蛋氨酸、赖氨酸和异亮氨酸代谢途径，同时光合作用相关基因和柠檬酸循环相关基因的表达也降低，这为细胞死亡的进程提供了证据。此外，Threonine 处理后，ThrC 的表达意外上调 10.5 倍，引发了对其实际功能的质疑。RT-PCR 结果证实了 ThrC 在 Threonine 丰富条件下的高表达，而蛋氨酸处理可使 ThrC 表达恢复到对照组水平。
蛋白质组数据与转录组趋势一致，Threonine 处理导致参与能量生成和一般应激反应的蛋白质减少，同时 ThrC 的丰度增加 1.4 倍。量化游离氨基酸和总蛋白质浓度的结果表明，Threonine 处理的细胞存在翻译应激。
2. 氨基酸谱的代谢组学分析
利用液相色谱 - 串联质谱（LC-MS/MS）分析发现，Threonine 处理的铜绿微囊藻细胞中 86 种氨基酸及其衍生物的水平发生了变化，包括 Threonine、高丝氨酸等代谢物的显著增加以及丙氨酸、蛋氨酸等的减少。Threonine 处理导致细胞中未使用的 Threonine 浓度增加，抑制了高丝氨酸激酶（ThrB），进而导致高丝氨酸积累和 OPHS 减少，这可能与蛋氨酸浓度降低有关。此外，Threonine 处理组中尿囊酸（一种嘌呤降解产物）水平显著升高，但其具体机制尚待进一步研究。
丙氨酸处理可使细胞的代谢组学谱恢复到接近对照组的水平，这可能是由于丙氨酸对假定的苏氨酸脱氨酶（本研究中的 ThrC）的反馈抑制作用。蛋氨酸处理则通过逆转 Threonine 应激下的蛋氨酸消耗来缓解 Threonine 毒性。甘氨酸与过量蛋氨酸联合使用可有效减轻 Threonine 毒性，表明甘氨酸可能作为核苷酸合成的辅助因子在 Threonine 处理的铜绿微囊藻细胞中发挥作用。
3. 苏氨酸合酶作为苏氨酸脱氨酶的兼职功能
铜绿微囊藻 PCC7806 中 ThrC 的结构与大肠杆菌中 ThrC 和苏氨酸脱氨酶（IlvA）的结构相似度较低，其 N 端存在未鉴定的催化域，C 端的调节域也不完整，这暗示 ThrC 可能具有兼职功能。
通过 2,4 - 二硝基苯肼（2,4-DNPH）检测发现，Threonine 处理的细胞中酮酸生成量比对照组高 3 倍，而丙氨酸或蛋氨酸处理的细胞中酮酸生成量无变化。体外实验表明，纯化的 ThrC 可利用 PLP 作为催化剂将 Threonine 降解为酮酸，且 ThrC 对 OPHS 的亲和力高于对 Threonine 的亲和力。酶动力学分析显示，ThrC 作为苏氨酸合酶时遵循米氏动力学，而作为苏氨酸脱氨酶时表现出 S 形动力学，这表明在 Threonine 丰富的条件下，ThrC 可作为苏氨酸脱氨酶发挥作用。
4. 对 α- 酮丁酸生成和细菌细胞包膜完整性的影响
体内和体外数据表明，ThrC 介导的氨基酸失衡和有毒 aKB 的产生可能导致细胞毒性。高浓度的细胞外 aKB（100 μM）对铜绿微囊藻无毒，这是因为其基因组中缺乏 aKB 摄取系统。但二甲基亚砜（DMSO）处理增加细胞通透性后，铜绿微囊藻对 aKB 变得敏感。添加苏氨酸脱氨酶抑制剂（如异亮氨酸和丝氨酸）可减轻 Threonine 的抑制活性。此外，Threonine 处理导致细胞内 H2O2产生减少，这表明 aKB 介导的细胞死亡与一般的氧化应激无关。
Threonine 处理导致铜绿微囊藻细胞中与氨基酸相关和类异戊二烯代谢物水平降低，影响了细胞膜完整性。转肽酶活性分析显示，Threonine 处理的细胞中细胞壁前体供应缓慢，导致转肽酶活性降低，同时细胞出现异常的肽聚糖连接和膜化学变化。
5. ThrC 在苏氨酸合酶家族中的独特谱系
对 88 个 ThrC 及相关苏氨酸代谢酶（IlvA、Tdc 和 Tdh）的序列分析发现，存在一个独特的 ThrC 谱系，与经典的苏氨酸合酶家族不同。该独特谱系仅在蓝藻属中观察到，包括铜绿微囊藻、聚球藻属和念珠藻属等。其进化位置介于经典苏氨酸合成和脱氨相关蛋白质之间，这表明 ThrC 可能是苏氨酸合酶向苏氨酸脱氨酶进化的分支点。结构建模支持铜绿微囊藻 ThrC 的双功能特性，而在一些快速生长的异养细菌中不存在这种独特的 ThrC 谱系，这可能与它们对营养丰富环境的快速进化适应有关。
讨论
氨基酸对细菌生长和细胞内稳态至关重要，但缺乏或过量都会导致细胞毒性。细菌通过精细调节氨基酸代谢来适应环境，而像铜绿微囊藻这样缺乏精细调节系统的细菌，其生长依赖于相关细菌提供的营养或解毒作用。Threonine 对不同细菌的毒性存在差异，仅对特定的蓝藻亚群有毒性。
Threonine 降解途径在不同细菌谱系中的进化不一致，这增加了研究单个细菌基因组中多种苏氨酸合酶和脱氨酶进化历史的难度。基因复制和序列 divergence 可能导致 ThrC 进化出双功能，这种适应可能减少了代谢途径中对多种蛋白质的需求，降低了 DNA 含量。然而，尚不清楚蓝藻在进化过程中为何会发展出双功能的 ThrC 而未完善其调节机制。
aKB 在细胞内的主要作用靶点尚不清楚，但它的积累可能通过 ThrC 的兼职功能和氨基酸失衡导致细胞死亡。氨基酸代谢与脂质生物合成和膜完整性密切相关，Threonine 处理导致的氨基酸失衡可能影响脂质代谢，进而破坏细胞膜完整性。不同细菌对氨基酸摄取和代谢的机制复杂多样，如苏氨酸对铜绿微囊藻的毒性只能由丙氨酸或蛋氨酸（或与甘氨酸一起）缓解，而不能由缬氨酸缓解。
研究还发现，铜绿微囊藻中的 ThrC 与链霉菌中的同型半胱氨酸合酶（MetM）具有 51.6% 的氨基酸序列同一性，暗示 ThrC 可能是 MetM 的同源物。但在 Threonine 处理的铜绿微囊藻细胞中，ThrC 似乎并未完全发挥 MetM 在蛋氨酸生物合成途径中的功能，这可能与硫的可用性等因素有关。这些结果表明 ThrC 在蓝藻氨基酸代谢中具有多方面的作用，尤其是在 Threonine 和蛋氨酸途径中。
材料和方法
- 铜绿微囊藻的培养条件：铜绿微囊藻细胞在无菌 BG-11 培养基中，于 25°C、12 - 12 h 光暗周期、25 μmol 光子 m-2 s-1的光照强度下培养。培养基包含多种营养成分，所有氨基酸配制成 0.1 M 的储备液，接种时细胞的初始光密度（OD680）为 0.2，培养至指数生长期（OD680 ~1.0）后用于实验。
- 显微镜分析：对用氨基酸（Threonine、Threonine + 丙氨酸、Threonine + 蛋氨酸；50 μM）处理或未处理的细胞进行扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）分析，样品按先前方法固定和制备。用 SYTO9 染料、4',6 - 二脒基 - 2 - 苯基吲哚（DAPI）和 7 - 羟基香豆素氨基 - D - 丙氨酸（HADA）标记铜绿微囊藻 PCC7806 细胞，使用共聚焦激光扫描显微镜检测，同时观察叶绿素 a 的自发荧光和测量培养物中的溶解氧水平。
- 转录组分析和定量逆转录 PCR：对暴露于氨基酸（Threonine、Threonine + 丙氨酸、Threonine + 蛋氨酸）1 h 的铜绿微囊藻 PCC7806 细胞进行转录组分析，以未暴露细胞为对照。提取总 RNA 后进行 RNA 测序，测序数据比对到参考基因组，使用 edgeR 包进行差异基因表达分析，筛选出 FDR < 0.05 且 | log2倍变化 | > 1 的差异表达基因。定量逆转录 PCR（qRT-PCR）以 cDNA 为模板，以 16S rDNA 基因为内参，对 ThrC 基因表达进行定量分析。
- 蛋白质组学分析：对在 BG11 培养基中添加或不添加 Threonine 培养 24 h 的铜绿微囊藻 PCC7806 菌株细胞进行凝胶基蛋白质组学分析。蛋白质样品经电泳、染色、切胶后进行肽分析，通过液相色谱 - 串联质谱鉴定蛋白质。使用特定的色谱和质谱条件进行分析，利用 Proteome Discoverer 软件搜索质谱数据，筛选出错误发现率小于 1% 的结果。
- 细胞活力分析：使用相应的检测试剂盒测定铜绿微囊藻 PCC7806 细胞中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）和三磷酸腺苷（ATP）的含量。通过测量细胞与十六烷混合后的光密度来评估细胞膜疏水性，使用 3,3'- 二乙基氧杂羰花青碘化物 [DiOC2(3)] 溶液评估细胞膜极化，利用 Amplex Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay Kit 测定细胞内过氧化氢（H2O2）水平。
- 蛋白质的系统发育树和 3D 同源性分析：使用 Molecular Evolutionary Genetics Analysis（MEGA）软件版本 11 生成系统发育树，进行多序列比对并采用最大似然算法和 1000 次自展重复分析。使用 PyMOL 软件版本 2.4.0 可视化 3D 结构，3D 晶体结构数据来源于 Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank（RCSB PDB）和 AlphaFold Protein Structure Database。
- 用于体外实验的 His 标记蛋白的过表达和纯化：通过 PCR 从铜绿微囊藻 PCC7806 基因组 DNA 中扩增 ThrC 基因，克隆到 pET - 28b (+) 载体后转化到大肠杆菌 BL21 (DE3) 细胞中。用异丙基 -β-D - 硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达 His6标记的 ThrC，超声破碎细胞后离心收集上清，通过 HisPur Ni - NTA Purification Kit 纯化蛋白质。使用特定的缓冲液进行分光光度测量，并通过凝胶过滤平衡 ThrC 蛋白。
- 细胞和酶促形成 α- 酮酸的检测：使用 2,4-DNPH 与 aKB 的羰基反应生成有色产物 aKB - 2,4-DNP - 腙，通过比色法检测细胞中 aKB 的含量。采用改良方法检测 ThrC 的苏氨酸脱氨酶活性，通过光谱分析和添加 2,4-DNPH 溶液验证 aKB 的生成。
- 微囊藻中氨基酸衍生物的代谢组学分析：对培养 24 h 的铜绿微囊藻样品进行代谢组学分析。细胞沉淀经提取、离心、干燥、复溶后，使用高效液相色谱 - 三重四极杆质谱（HPLC - QQQ/MS）进行代谢物分析。采用特定的色谱柱和梯度洗脱条件，在正负离子模式下进行分析，并对代谢组学数据集进行标准化处理和注释，数据存储于 MetaboLights 数据库。同时，使用茚三酮法测定铜绿微囊藻 PCC7806 细胞中总游离氨基酸的比例。
- 统计分析：实验数据进行三次重复，结果以平均值 ± 标准误差表示。使用单因素方差分析和最小显著差异检验评估显著性，P < 0.10（*）和 P < 0.05（**）被认为具有统计学意义，分析使用 Microsoft Office 365 for Windows 进行。
本研究通过多组学分析和实验验证，深入揭示了 Threonine 对蓝藻的毒性机制以及 ThrC 的兼职功能，为理解营养敏感型细菌在营养丰富条件下的死亡机制提供了重要依据，也为进一步研究细菌的氨基酸代谢和环境适应机制奠定了基础。
