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本文系统综述了大蜡螟（Galleria mellonella）在金属纳米颗粒研究中的应用。其作为体内模型，可评估纳米颗粒毒性、治疗潜力及免疫反应影响。但目前研究存在方法不规范等问题，未来应规范实验方法，拓展研究范围。
1. 引言
在医学、电子和环境科学等众多领域，纳米颗粒（NPs）的研究至关重要。为深入了解其作用、分布和治疗潜力，多种动物模型被广泛应用。例如，啮齿动物常用于研究纳米颗粒的药代动力学、生物分布、毒性和治疗潜力；斑马鱼因其胚胎透明，成为研究纳米颗粒毒性和发育影响的重要模型；兔子常用于眼科疾病相关的纳米颗粒研究；猪在皮肤相关的纳米颗粒研究中具有价值；非人类灵长类动物则在需要与人类高度相似的研究中发挥作用。然而，这些传统模型存在成本高、伦理问题和监管严格等局限。
大蜡螟（Galleria mellonella）作为一种新兴的体内模型，具有诸多优势。它成本低、易于操作，且伦理问题较少。在金属纳米颗粒研究中，大蜡螟幼虫可用于评估纳米颗粒的毒性，通过观察幼虫的致死率、行为变化和生理改变来获取关键信息。同时，还能用于研究纳米颗粒的生物分布，借助成像技术追踪颗粒在不同组织中的运动和积累。此外，大蜡螟能感染多种病原体，拥有包括细胞和体液成分的先天免疫系统，这使其成为研究纳米颗粒抗菌效果和免疫反应的理想模型。而且，在将纳米颗粒应用于更复杂的生物体之前，大蜡螟可作为优化纳米颗粒配方的初步平台。
2. 材料和方法
本系统综述严格遵循系统评价和荟萃分析的首选报告项目（PRISMA）指南进行。研究人员检索了 MEDLINE、Embase、Cochrane、Scopus、Google Scholar 和科学引文索引扩展版（Web of Science）等多个数据库，使用了 “galleria mellonella nanoparticles”“metal nanoparticles galleria mellonella”“nanoparticle galleria mellonella” 等关键词，且检索不受限制。
在筛选文献时，由两名评审员（R.V.O. 和 A.M.B.）根据预先设定的纳入标准，独立筛选数据库检索得到的标题和摘要。对于可能相关或资格不确定的文献，获取全文进行评估。若对研究的资格存在疑问，会联系相应作者进行澄清。评审员之间的分歧通过讨论解决，若无法达成共识，则由第三位监督研究的评审员（C.C./A.F./G.A.F.）做出最终决定，并记录排除特定研究的所有原因。
纳入标准包括已发表的体内实验研究，以大蜡螟为动物模型，研究中引入了金属纳米颗粒和 / 或含金属元素的纳米复合材料，且报告了至少一项如存活率、治疗效果、组织学分析、表型改变、免疫反应、纳米颗粒的药代动力学和药效学以及对生物膜形成的影响等结果。
数据提取由两名作者（R.V.O. 和 A.M.B.）使用专门设计的数据提取表进行，提取内容涵盖报告细节、实验设计、动物模型、纳米颗粒、干预措施、主要结果和次要结果等方面。提取后，还会审查入选论文的参考文献，以发现可能遗漏的研究。
风险偏倚评估采用 SYRCLE 的动物研究风险偏倚工具，并针对大蜡螟研究进行了特定要求的补充。例如，在序列生成方面，要求明确描述随机化方法；在基线特征方面，需比较幼虫的关键特征并排除异常幼虫；在分配隐藏方面，使用特定方法确保研究人员不知道幼虫的分组等。此外，还增加了复制和时间一致性等评估标准。
3. 结果和讨论
通过检索策略，共识别出 1696 项研究，经过筛选和参考文献审查，最终有 31 项研究符合纳入标准。这些研究涉及多种金属纳米颗粒，其中银纳米颗粒（AgNPs）研究最多，占比 35.48%，其次是氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）、二氧化钛纳米颗粒（TiO2 NPs）等。
在纳米颗粒的合成方法上，商业纳米颗粒使用最为广泛，其次是生物合成和化学合成。生物合成中，真菌和植物提取物合成较为常见；化学合成中，物理化学方法报道最多。纳米颗粒的给药方式以注射为主，主要注射部位为幼虫的后腿和前腿，其次是将纳米颗粒掺入人工饲料和强制喂食。
利用改良的 SYRCLE 风险偏倚工具对研究进行评估发现，研究在方法学透明度和严谨性方面存在差异。选择偏倚是一个关键问题，特别是在序列生成和分配隐藏方面，许多研究存在不明确的风险评级，这表明随机化程序缺乏透明度。虽然基线特征评估大多为低风险，但仍存在不一致性。在性能和检测偏倚方面，大多数研究采用了随机分组，但缺乏明确的盲法实践，这可能会影响实验结果的可靠性。不过，在损耗和报告偏倚方面，研究结果较为乐观，数据完整性和报告透明度较高。此外，实验的复制和时间一致性方面也存在不足，许多研究虽提及复制实验，但缺乏详细信息，这对研究结果的可重复性和可靠性产生了影响。
3.1. 毒性评估
大蜡螟幼虫是评估金属纳米颗粒毒性的重要体内模型。在已纳入的 31 篇文章中，14 篇将纳米颗粒对大蜡螟的毒性评估作为主要研究结果。评估纳米颗粒毒性的参数丰富多样，包括存活率、生存分析、行为变化、血细胞计数、黑化现象、体重和生长指标、组织病理学检查以及生化分析等。
存活率是评估纳米颗粒毒性的关键指标，通过比较处理组和对照组的死亡率，能直接反映纳米颗粒的致死性。许多研究通过测定半数致死浓度（LC50）和 / 或多个 LC 值来确定纳米颗粒的毒性，并以此为基础确定亚致死剂量进行进一步研究。然而，不同研究中纳米颗粒的毒性水平差异显著，这主要取决于纳米颗粒的组成和物理化学性质，同时暴露时间也会对 LC 值产生影响。例如，Eskin 等报道氧化铜纳米颗粒（CuO NPs）的 LC50 为 6.03 μg/10 μl，而 Demirtürk 等发现氧化铝纳米颗粒（AlNPs）的 LC50 高达 788.96 ppm；Thomaz 等测定银纳米颗粒（AgNPs）在 24 小时的 LC50 为 68.70 mg/kg，Moya-Andírico 等测定不同纳米颗粒在 72 小时的半数致死剂量（LD50），Au (HAL) NPs 为 2023 mg/kg，硒纳米颗粒（SeNPs）为 89 mg/kg，AgNPs 为 939 mg/kg。此外，Yosri 等研究发现 TiNPs 与Metarhizium anisopliae结合具有协同毒性作用，Tun?soy 等关注 LC10 和 LC30 值，确定 CuO NP 的毒性阈值分别为 0.826 mg/L 和 43 mg/L。Rodrigues do Carmo Neto 等发现低剂量（5 - 10 mg/kg）的 ZnO 纳米复合材料对大蜡螟存活率影响较小，而高剂量（50 - 100 mg/kg）则显著降低其存活率。
生存分析通过建立剂量 - 反应关系，绘制生存曲线，展示不同浓度纳米颗粒处理下幼虫的存活数量随时间的变化情况，从而更细致地了解纳米颗粒的剂量相关效应。例如，Ottoni 等发现 AgNP 暴露浓度高达 1 mM 时，在 28°C 下幼虫存活率超过 80%；Xu 等报道 ZnO NPs 具有显著的剂量依赖性死亡率，LD50 为 400 mg/kg，LD99 为 800 mg/kg。此外，温度等环境条件也会影响纳米颗粒的毒性结果，Rigotto Caruso 等评估不同 NP 配方的毒性，发现 AgNO3导致显著死亡率，而 AgNPs 和复合配方毒性较小。
观察幼虫的行为变化也是评估毒性的重要参数，如 Moya-Andírico 等发现注射 AgNPs 的大蜡螟幼虫运动明显减少，SeNP 处理的幼虫几乎完全不动。Pompilio 等观察到不同浓度 AgNPs 处理下幼虫的死亡率变化，Abdul Hak 等发现双金属 Ag - CuO NPs 与粘菌素结合对幼虫无明显毒性。
血细胞计数能反映纳米颗粒对组织损伤或免疫抑制的潜在影响，减少的血细胞数量可能表明存在不良毒性效应。例如，Eskin 和 Bozdo?an 发现暴露于 100 μg CuO NPs 会增加血细胞计数，但高剂量下细胞活力显著下降；Eskin 等观察到 5 μg/10 μl ZnO NP 暴露使死细胞增加，表明存在氧化应激诱导的细胞毒性；Moya-Andírico 等发现血细胞减少与幼虫行为受损相关；Artunduaga Bonilla 等发现 Ag - 壳聚糖纳米复合材料在 20 μg/ml 时能维持幼虫 100% 的活力且不影响血细胞。
黑化现象是大蜡螟对纳米颗粒暴露的一种生理反应，可能表明免疫反应或应激，但目前在毒性研究中对其直接评估较少。Bonilla 等是少数将黑化率作为 NP 毒性评估一部分的研究人员。
幼虫的体重和生长指标以及化蛹率等能反映慢性或亚致死毒性效应。Eskin 研究发现 250 μg/10 μl Fe3O4纳米颗粒处理会增加蛹的重量并延长成虫发育时间，但与对照组相比，蛹发育时间、蛹和成虫体重以及成虫寿命无显著差异。
组织病理学检查可揭示纳米颗粒诱导的形态变化或损伤。Moya-Andírico 等通过组织学分析发现，不同纳米颗粒在大蜡螟幼虫体内的分布和积累模式不同，SeNPs 积累最多，形成大的星状聚集体，AgNPs 和 Au (HAL) NPs 则形成较小的分散聚集体。
目前纳米颗粒毒性评估存在缺乏方法标准化的问题，暴露浓度、观察期和评估指标存在显著差异，且对慢性暴露的影响研究较少。未来研究应规范 LC50/LD50 测定方法，整合多种评估方法，加强组织病理学和氧化应激分析，以更全面地评估纳米颗粒的毒性机制。
3.2. 纳米颗粒对大蜡螟免疫反应的影响
评估金属纳米颗粒对大蜡螟幼虫免疫反应的影响，常用的方法包括生存分析、血细胞计数、酚氧化酶活性测定、吞噬作用测定、细胞因子样分子测量、结节形成和黑化评估、组织病理学分析、基因表达研究以及蛋白质组学和代谢组学分析等。这些方法从不同角度全面地揭示了纳米颗粒对大蜡螟免疫系统的影响，有助于深入了解其安全性和潜在的生物医学应用。本部分共综述了 10 项相关研究。
金属纳米颗粒对大蜡螟免疫的影响因纳米颗粒的组成、浓度和暴露时间而异。Alt?nkaynak 等发现高浓度的纯磷酸铜纳米花（p-CPnfs）显著增加大蜡螟的血细胞计数并改变酶活性，表明其诱导氧化应激和神经生理紊乱的同时刺激血细胞增殖。Tun?soy 等发现饮食中的 CuO NPs 对大蜡螟有显著的代谢和生化影响，导致多种酶活性和代谢物水平变化，同时引起血细胞计数的显著变化，表明存在全身代谢应激和潜在的神经毒性。
TiO2 NPs 暴露影响大蜡螟的生物积累模式和免疫反应。Tuncsoy & Mese 发现 TiO2主要在马氏管积累，与抗氧化防御的显著变化相关，同时影响血细胞总数。Tuncsoy & Tuncsoy 观察到 Al2O3暴露导致大小依赖的免疫改变，纳米颗粒和微米级颗粒在不同组织积累，酶反应也因颗粒大小而异。
ZnO NPs 表现出浓度依赖性的免疫效应。Eskin & Nurullaho?lu 报道 1000 - 5000 ppm 的 ZnO NPs 降低平均血细胞计数并改变包封反应和黑化现象。Demirtürk 等发现 Al NPs 在较低浓度（≥50 ppm）时显著抑制包封能力和酚氧化酶活性，表明 Al NPs 可能比 ZnO NPs 具有更强的免疫抑制作用。Eskin 分析了 ZnO NP 暴露后血细胞类型分布的变化，发现对特定血细胞群体有选择性毒性。
这些研究表明，大蜡螟是评估纳米颗粒诱导的免疫调节的有价值模型。不同金属和金属氧化物纳米颗粒，如 TiO2、CuO、Al2O3和 ZnO，均改变了血细胞活性，其作用效果在免疫刺激和免疫抑制方面有所不同。纳米颗粒暴露以剂量依赖的方式影响多种免疫和代谢途径，不同纳米颗粒在积累模式、免疫调节作用和对不同血细胞类型的影响上存在差异。未来研究应关注纳米颗粒暴露对大蜡螟免疫功能的慢性影响，并探讨与脊椎动物免疫反应的潜在相似性。
3.3. 大蜡螟作为体内感染模型评估纳米颗粒的抗菌效果
大蜡螟幼虫模型广泛用于评估金属纳米颗粒的体内抗菌效果。研究人员采用多种实验方法，包括存活率测试、细菌计数评估、免疫反应参数检测、细胞毒性测定和组织病理学检查等，全面评估纳米颗粒的抗菌功效和安全性。
存活率测试通过监测感染病原体后用金属纳米颗粒处理的幼虫的存活情况，较高的存活率表明纳米颗粒可能具有抗菌活性。细菌计数评估则通过解剖处理后的幼虫，量化组织中的细菌载量，直接衡量纳米颗粒治疗导致的细菌清除情况。免疫反应参数检测，如黑化率和血细胞密度的变化，有助于了解幼虫先天免疫系统对感染和纳米颗粒暴露的反应。细胞毒性测定，如乳酸脱氢酶（LDH）测定，可确定观察到的抗菌效果是由于纳米颗粒杀死细菌还是对幼虫细胞有毒性。组织病理学检查能揭示感染或纳米颗粒暴露引起的形态变化或组织损伤，帮助区分纳米颗粒和病原体各自的作用。
不同纳米颗粒的组成显著影响其抗菌功效。单金属纳米颗粒，尤其是银纳米颗粒，在大蜡螟中始终表现出抗菌活性，但受合成方法、颗粒大小和表面化学等因素影响。例如，Thomaz 等发现 25 mg/kg 的 AgNPs 可完全清除大蜡螟体内的Pseudomonas aeruginosa，而较低浓度则无效；Arsene 等观察到用Enantia chlorantha树皮提取物合成的 AgNPs 对不同细菌菌株的抗菌效果不同。双金属纳米颗粒常因协同作用表现出增强的抗菌活性，如 Abdul Hak 等发现 Col - Ag - CuO NPs 对P. aeruginosa的保护作用优于单金属 AgNPs。
功能化纳米颗粒通过增强稳定性、细菌靶向性和免疫相互作用提高抗菌功效。Alves 等发现玫瑰果功能化的 Mg (OH)2 NPs 对S. aureus的抗菌活性显著高于未功能化的纳米颗粒；Prasastha Ram 等发现 Ag - 肉桂醛（AgC）NPs 在治疗耐多药大肠杆菌（MDR - E. coli）感染方面优于单独的 AgNPs。
金属氧化物纳米颗粒，如 ZnO 和 TiO2，通过活性氧（ROS）生成、膜破坏和免疫调节等机制发挥抗菌作用。Xu 等发现 2 mg/kg 的 ZnO NPs 对Candida albicans的保护作用优于两性霉素 B，且能增强免疫反应。然而，纳米颗粒的性能并不总是一致的，Stauber 等发现 AgNPs 在涂层后抗真菌效果显著降低。
纳米颗粒的抗菌效果还取决于目标病原体。Arsene 等观察到 AgNPs 对E. coli的抗菌效果优于S. aureus，Thomaz 等发现 AgNPs 对P. aeruginosa的抗菌效果与浓度有关。这些研究结果
